Не, ну яка рукотворность? Що за маячня? Думав я, коли вперше почув гіпотезу про те, що Ковід-19 викликаний чи лабораторної витоком, то чи взагалі цілеспрямованої біоатак. І кожен раз просто відмахувався від цих домислів, коли вони в черговий раз допливали до мене в бурхливому потоці Коронавірусние інфошума. Ну подумаєш, є в Ухані інститут вірусології, хіба мало.
У якийсь момент відмахуватися вже довелося аргументовано, тому що прихильники рукотворності почали обґрунтовувати свої тези про можливу штучної природи вірусу доводами з молекулярної біології, і тут вже хотілося в пух і прах розбити їх конспірологію холодними науковими фактами. Якщо вже не як автори статті в Nature (здавалося мені), то хоча б як шановний мною Панчина .
І ось тут, в гонитві за доводами проти рукотворності вірусу, мене і заразив вірус сумнівів. У чому, власне, причина сумнівів? У тому, що чим глибше занурюєшся в діяльність коронавірусологов за останні 15-20 років, тим краще розумієш, що створення рівно таких химер як CoV2 у них було звичайною справою. А CoV2 - це очевидна химера, заснована на летучемишіном штамі RaTG13, у якого в шиповидном білку місце зв'язування з рецептором (RBM) замінено з летучемишіного на панголіни, до того ж врізаний особливий ділянку з 4-х амінокислот, який створив furin cleavage site, який, як раніше з'ясували вірусологи, значно розширює «репертуар» вірусу в плані того, в чиї клітини він може проникати. Швидше за все, саме завдяки цьому новому фуріновому сайту, новий мутант і зумів перескочити з вихідних носіїв на людей.
З урахуванням тих висот, яких сьогодні досягла генна інженерія, синтетично зібрати CoV2 за вищеописаною методикою не склало б труднощів навіть початківцю фахівця. Адже вірусологи, включаючи керівника Коронавірусние напрямки в Уханьского інституті вірусології Ши Чженлі , такими речами вже неодноразово займалися - як заміною RBM у одного виду вірусу на RBM з іншого(ось робота групи Ши Чженлі від 2007 року), так і додаванням нового фурінового сайту, здатного дати специфічного до одного виду тварин Коронавіруси можливість почати використовувати рецептор ACE2 інших видів.
Хвилинка турботи від НЛО
У світі офіційно оголошена пандемія COVID-19 - потенційно важкої гострої респіраторної інфекції, спричиненої коронавірусів SARS-CoV-2 (2019 nCoV). На Хабре багато інформації по цій темі - завжди пам'ятайте про те, що вона може бути як достовірною / корисної, так і навпаки.
Ми закликаємо вас критично ставитися до будь-якої інформації, що публікується інформації
Офіційні джерела
Якщо ви проживаєте не в Росії, зверніться до аналогічних сайтів вашої країни.
Мийте руки, бережіть близьких, по можливості залишайтеся вдома і працюйте віддалено.
Ши Чженлі в своїй лабораторії в Уханьского інституті вірусології
Але перш ніж розводити тут конспірологію, давайте спочатку зануримося в біо логию.
Біологія
Отже, почнемо від печі. Що за фуріновий сайт, що за RBM, що взагалі за шіповідний білок? Насправді, якщо продертися крізь нетрі термінології, то концептуально все просто. Ось, наприклад, шіповідний білок - це та сама стирчить з вірусної частинки штука (S protein), за яку ці віруси і "коронували":
Саме за допомогою цих білків вирион чіпляється за рецептор клітини-жертви (ACE2 в нашому випадку), щоб потім проникнути всередину. Тому можна сказати, що це найважливіша частина вірусу, адже саме вона визначає яких тварин той може вражати, а яких ні - ACE2 рецептори у різних видів трохи структурно відрізняються. При цьому з усього величезного по вірусним мірками 30-кілобазного генома, ген цього білка становить лише 12-13%, тобто близько 1300 амінокислот. Ось так структурований шіповідний білок у CoV2 і його близьких родичів:
Як видно з малюнка вище, S білок складається з двох субодиниць: S1 і S2. Саме S1 взаємодіє з рецептором ACE2, і те місце, яким він це робить, називається Receptor Binding Domain (RBD), а область безпосереднього контакту, святая святих, називається Receptor Binding Motif (RBM). Ось гарна ілюстрація з не менше красивою роботи :
Загальна структура RBD CoV2, пов'язаного з ACE2.(а) Загальна топологія мономера шиповидного білка 2019 nCov. NTD, N-термінальний домен. RBD, рецептор-зв'язуючий домен. RBM, рецептор-зв'язуючий мотив. SD1, піддомен 1. SD2, піддомен 2. FP, пептид злиття. HR1, гептадний повтор 1. HR2, гептадний повтор 2. TM, трансмембранная область. IC, внутрішньоклітинний домен. (б) Послідовність і вторинні структури RBD 2019 nCov. RBM забарвлений в червоний колір. (с) Загальна структура RBD 2019 nCov, пов'язаного з ACE2. ACE2 забарвлений в зелений колір. Ядро RBD 2019 nCoV забарвлене в блакитний колір, а RBM - в червоний. Дисульфідні зв'язки в RBD 2019 nCov показані в вигляді лінії і позначені жовтими стрілками. N-кінцева спіраль ACE2, відповідальна за зв'язування, позначена.
Початковий текст
Загальна структура RBD 2019-nCoV пов'язана з ACE2.(а) Загальна топологія мономеру шипа 2019-nCoV. NTD, N-термінальний домен. RBD, домен, що зв'язує рецептори. RBM, мотив, що зв'язує рецептори. SD1, піддомен 1. SD2, піддомен 2. FP, синтез-пептид. HR1, повтор гептаду 1. HR2, повтор гептаду 2. TM, трансмембранна область. ІК, внутрішньоклітинний домен. (b) Послідовність і вторинні структури РБД 2019-nCoV. Кольцева стрічка кольорового кольору. (с) Загальна структура RBD 2019-nCoV, пов'язана з ACE2. ACE2 кольоровий зелений. Ядро RBD 2019-nCoV пофарбоване в блакитний колір, а кольорові ручки - у червоний колір. Дисульфідні зв’язки в RBD 2019-nCoV показані як палиця та позначені жовтими стрілками. Позначена N-кінцева спіраль ACE2, що відповідає за зв'язування.
Так ось. Коли геном CoV2 тільки розшифрували, то спочатку не було відомо якихось прям близькоспоріднених йому штамів. Але вже 23 січня 2020 року Ши Чженлі випустила роботу , в якій оголосила, що CoV2 на 96% збігається зі штамом RaTG13, який її лабораторія в 2013 році виділила з Юньнаньськоє кажанів. Правда, поза нею лабораторії до січня 2020 року про цьому штамі не було відомо нікому.
Було відразу зрозуміло, що RaTG13 - хлопчик особливий. Погляньте на графік:
Це графік схожості CoV2 з іншими відомими штамами. Чим вище крива, тим вище відсоток збігу нуклеотидів. Як бачимо, в районі гена того самого шиповидного білка (S) тільки RaTG13 більш-менш близький до CoV2, а всі інші штами в цьому місці йдуть у піке - як штами вірусів з інших кажанів, так і перший SARS-CoV (червона крива ). Але тут поки немає нічого підозрілого - хіба мало ще невідомих науці штамів таять в собі незвідані Юньнаньськоє печери? Ну так, не дуже зрозуміло як саме вірус звідти добрався до Ухань, але чого не буває.
Панголіни
Далі на сцені з'являються панголіни: в лютому інша група китайських вчених виявила в своїх засіках штам панголіни коронавируса, який, хоч в цілому і гірше ніж RaTG13 був схожий на CoV2 (на 90%), в тому самому RBM шиповидного білка був майже ідентичний - відрізнявся лише на 1 амінокислоту (див. два верхніх сиквенсу, точки означають збіг з першим сиквенс):
При цьому в першій чверті S білка панголіни штам на CoV2 не схожий, а послідовність після RBM у всіх трьох штамів (CoV2, Pangolin, RaTG13) більш-менш збігається. Але ось сам RBM у RaTG13 вельми відрізняється від CoV2, що видно по крутому провалу зеленого графіка RaTG13 в порівнянні з червоним графіком CoV2 в районі RBM (вертикальна рожева смуга) в наступній діаграмі:
Цю різницю підтверджує і філогенетичний аналіз цих трьох областей, виділених на графіку вище - по RBM штам панголіни ближче до CoV2, ніж RaTG13, а ось ліворуч і праворуч від RBM до CoV2 ближче саме RaTG13. Тобто в наявності явна рекомбінація, про що згадують і самі автори, і деякі інші роботи.
До речі, звідки взялися у дослідників ці самі панголіни? А ось звідси:
Їх конфіскувала у контрабандистів китайська митниця і передала в реабілітаційний центр в Гуандуні, де вони померли при вираженій коронавирусной симптоматиці. Це, звичайно, не могло не зацікавити місцевих вірусологів, які і виділили у них різний біоматеріал:
Панголіни, використані в дослідженні, були конфісковані митницею і Департаментом лісового господарства провінції Гуандун в березні-грудні 2019 року. В їх число входять чотири китайських панголіни ( Manis pentadactyla ) і 25 малайських панголінів ( Manis javanica ). Ці тварини були відправлені в центр порятунку диких тварин; в основному вони були неактивні і задихалися, і в кінцевому підсумку померли, не дивлячись на великі зусилля для їх порятунку. Зразки тканин були взяті з легких, лімфатичних вузлів, печінки, селезінки, м'язів, нирок та інших тканин у щойно померлих панголінів, для гістопатологічних і вірусологічних досліджень.
Початковий текст
Панголіни, які використовувались у дослідженні, були конфісковані митницею та департаментом лісового господарства провінції Гуандун у березні-грудні 2019 року. Вони включають чотири китайські панголіни (Manis pentadactyla) та 25 малайських панголінів (Manis javanica). Ці тварини були відправлені в центр порятунку дикої природи, які були в основному неактивними і ридаючими, і врешті загинули під вартою, незважаючи на виснажливі зусилля по рятуванню. Зразки тканини були взяті з легенів, лімфатичних вузлів, печінки, селезінки, м’язів, нирок та інших тканин у панголінів, які щойно померли при гістопатологічних та вірусологічних дослідженнях.
До речі, і не тільки місцевих, тому що інші китайські дослідники (гонконгські в даному випадку) теж отримували зразки конфіскованих панголінів і в лютому 2020 теж випустили схожу роботу , зазначивши явні ознаки рекомбінації в шиповидном білку CoV2:
Ми отримали зразки заморожених тканин (легких, кишечника, крові), які були взяті у 18 малайських панголінів ( Manis javanica ) протягом серпня 2017 року - січня 2018 року. Ці панголіни були отримані в ході операцій по боротьбі з контрабандою митницею Гуансі. Вражаюче, що високопродуктивне секвенування їх РНК виявило присутність коронавірусів в шести (два легких, два кишечника, одна суміш легких і кишечника, одна кров) з 43 зразків. ... Більш помітним, однак, було спостереження передбачуваних сигналів рекомбінації між коронавірусами панголінів, коронавірусами кажанів RaTG13 і 2019 CoV2 людини (Рис. 1c, d). Зокрема, 2019 CoV2 демонструє дуже високу схожість послідовностей з коронавірусами панголіни з провінції Гуандун в рецептор-зв'язує домені (RBD; схожість амінокислот 97,4%; позначено червоною стрілкою на рис. 1c і рис. 2a), хоча в решти вірусного генома 2019 CoV2 найближче до RaTG13. У той же час RaTG13 і 2019 CoV2 мають тільки 89,2% подібності амінокислот в RBD. Коронавіруси панголінів з Гуандуна і 2019 CoV2 містять ідентичні амінокислоти в п'яти критичних залишках RBD, тоді як RaTG13 має тільки одну загальну амінокислоту з 2019-CoV2 з цих п'яти (залишок 442, нумерація SARS-CoV людини).
Початковий текст
Ми отримали зразки замороженої тканини (легенів, кишечника, крові), які були зібрані з 18 малайських панголінів ( Manis javanica ) протягом серпня 2017-січня 2018 р. Ці панголіни були отримані під час операцій проти контрабанди митницею Гуансі. Вражаюче, що високопропускна секвенування їх РНК виявила наявність коронавірусів у шести (дві легені, два кишечники, одна суміш легень та кишечника, одна кров) із 43 проб. За допомогою даних зчитування послідовності та заповнення прогалин послідовністю амплікону ми змогли отримати шість повних або майже повних послідовностей геномів - позначали GX / P1E, GX / P2V, GX / P3B, GX / P4L, GX / P5E і GX / P5L - які потрапляють у лінійку 2019-CoV2 (у межах роду Betacoronavirus) у філогенетичному аналізі (рис. 1а). … Більш помітним було, однак, спостереження за можливими сигналами рекомбінації між коронавірусами панголінів, коронавірусами кажана RaTG13 та людьми 2019-CoV2 (рис. 1в, г). Зокрема, 2019-CoV2 виявляє дуже високу схожість послідовності з коронавірусами панголіну Гуандунго в домені, що зв'язує рецептори (RBD; схожість амінокислот 97,4%; позначено червоною стрілкою на рисунку 1c та на рисунку 2a), хоча вона найбільш тісно пов'язана купати коронавірус RaTG13 в решті вірусного геному. Бат CoV RaTG та людина 2019-CoV2 мають лише 89,2% подібності амінокислот у RBD. Дійсно, коронавіруси гуандунського панголіну та 2019-CoV2 мають однакові амінокислоти у п’яти критичних залишках RBD, тоді як RaTG13 має лише одну амінокислоту з 2019-CoV2 (залишок 442, нумерація SARS-CoV людини).
До речі, автори цієї статті теж виділили явну филогенетическую мозаїчність шиповидного білка CoV2:
Цікаво, що філогенетичний аналіз тільки синонімічних сайтів в RBD показав, що філіпченкове положення Гуандунського панголіни узгоджується з положенням по іншій частині вірусного генома, а саме, що він не є найближчим родичем 2019 CoV2 (Figure 2b). Отже, можливо, що схожість амінокислот в RBD коронавирусов панголіни і 2019 CoV2 обумовлено селективно-опосередкованої конвергентної еволюцією, а не рекомбинацией, хоча на наявних даних важко вибрати між цими сценаріями.
Початковий текст
Цікаво, що філогенетичний аналіз поодиноких синонімічних сайтів у RBD виявив, що філогенетичне положення панголіну в Гуандуні відповідає узгодженню решти вірусного геному, а не є найближчим родичем 2019-CoV2 (мал. 2, б). Отже, можливо, що схожість амінокислот між РБД коронавірусів Гуандунського панголіну та 2019-CoV2 обумовлена вибірково опосередкованою еволюцією конвергенції, а не рекомбінацією, хоча важко вибрати між цими сценаріями за поточними даними.
У перекладі з наукового, слова авторів означають, що якщо проаналізувати весь RBD трьох штамів, відкинувши явні відмінності (несинонимичной заміни) між ними, які, в основному, припадають на RB M (який, нагадаю, ідентичний між CoV2 і Pangolin), і побудувати філіпченкове древо по синонімічним замін, то CoV2 таки ближче до RaTG13, а не до панголіни штаму. Що досить дивно в світлі того, що у панголіни з CoV2 ідентичний RBM (тобто відрізок усередині RBD).
Далі автори теоретизируют, що це може бути наслідком конвергентної еволюції, тобто, інакше кажучи, що штами CoV2 і панголінів прийшли до ідентичному RBM кожен своєю дорогою, а не через спільну рекомбінацію спільних предків. Тому що дійсно вже дуже дивна повинна була відбутися рекомбінація - як ніби хтось просто взяв шматок RBM з панголіни штаму і замінив їм RBM в RaTG13. А це вже скидається нема на еволюцію, а на, прости Дарвін, Intelligent Design.
Генеалогія коронованих осіб
Для того щоб краще зрозуміти походження CoV2, давайте ще раз глянемо на послідовності шиповидного білка у нашій трійці: CoV2, RaTG13 і панголіни - порівняємо попарно різницю між ними (точками відзначені ідентичні амінокислоти, червоні літери показують різницю, а прочерки позначають віддалені / додані амінокислоти) :
Неозброєним оком видно, що в першій чверті сиквенсу панголіни штам далекий від CoV2 і RaTG13. Ну а RaTG13, якби не ділянку в районі RBM (червоний прямокутник), був би дуууже близький до CoV2. Але, як я вже говорив, той самий ділянку у CoV2 найближче до панголіни штаму.
До речі, а що там у інших панголіни штамів? Давайте подивимося. Адже поки що ми аналізували тільки вірус, виділений з панголінів, конфіскованих митницею в 2019 році. А ще була партія панголінів, конфіскованих в 2017-му, і у них теж був виділений схожий штам. Якщо порівняти RaTG13 з геномами вірусів з панголінів 2017 і 2019 років, то тут теж все цікаво:
У першій чверті S білка панголіни штами від 2017 року ближче до RaTG13 (і CoV2) ніж їх панголіни побратим від 2019 го (MP789). При цьому, у всіх трьох явний недавній загальний предок в областях, виділених зеленими прямокутниками, і в цих областях RaTG13 і панголин-19 (MP789) до нього ближче, ніж панголин-17, так як у нього з RaTG13 кілька загальних мутацій (обведені червоними і синіми еліпсами), яких немає у легенди-17. При цьому RBM у всіх трьох різний, і різний приблизно в однаковій пропорції, і в схожих місцях.
Можливо, вже після того як предки RaTG13 і MP789 розійшлися, у MP789 відбулася заміна великої ділянки в першій чверті S білка (якої не відбулося у RaTG13 і панголіни-17), а інша частина S білка у всіх трьох залишилася загальної. А потім шляху генофондів RaTG13 і MP789 зійшлися знову і в пориві пристрасті породили CoV2. Також цілком можливо, що предок RaTG13 є результатом рекомбінації предків панголіни штамів.
Ще цікаво бачити досить унікальну однакову мутацію (QTQTNS) у RaTG13 і панголіни-19 прямо перед тим місцем, де у CoV2 знаходиться новий furin cleavage site, що виник через врізки 4-х нових амінокислот в цьому місці (PRRA). Якщо подивитися на нуклеотидную послідовність навколо цієї однаковою мутації, то видно, що RaTG13 і CoV2 по ній ближче один до одного, ніж до панголіни-19, так як встигли накопичити кілька загальних мутацій (виділені синім):
До речі, з Orf1ab у CoV2 теж філогенетична чехарда: 1a ближче до RaTG13, а ось 1b - до панголіни-19:
Тобто виходить, що предок CoV2 згрішив із загальним предком панголіни-19, як мінімум, двічі? Вперше - коли він (разом із загальним предком з RaTG13) успадкував Orf1ab і другу частину шиповидного білка з QTQTNS мутацією, а вдруге - коли придбав 1b разом з RBM, вже відрізняється від RaTG13-шних. Ні, звичайно, таке можливо і саме по собі не особливо примітно - адже ці віруси мутують і рекомбинируют постійно. Інше питання, де саме летучемишіние і панголіни віруси можуть один з одним зустрічатися для таких оргій - в гірських печерах, "мокрих ринках", притулках для конфіскованих тварин, або навіть в лабораторіях. Але давайте почекаємо з цими питаннями. Спочатку розглянемо самий кидається в очі аспект нового вірусу - врізку з 4-х амінокислот, котра перетворила його в супер-вбивцю.
Вріжуся акуратно, але сильно
Абсолютно неможливо ігнорувати цю врізку PRRA між S1 і S2. Як скалка стирчить вона в геномі нашого нового CoV2. Врізка ця не проста, а золота. Вона створює той самий furin cleavage site , про який я згадав на самому початку. Що це за звір? Спробую коротко пояснити. Пам'ятайте структуру нашого шиповидного білка? Ось наочна діаграма:
Білок складається з двох частин, S1 і S2, з яких S1 відповідає за первинний контакт з рецептором (той самий Receptor Binding Domain / Motif), а S2 відповідає вже за злиття з клітинної мембраною і проникнення в клітину. Запускає процес злиття зазначений жовтим fusion peptide, але для того щоб він почав свою брудну справу, хтось повинен розрізати S білок в одному з сайтів, виділених ромбиками на діаграмі вище. Своїх таких "різальник" у вірусу немає (є інші, Але це до справи не відноситься), тому він покладається на різні протеази своїх жертв, благо таких протеаз, як можна зрозуміти з кількості квітів тих самих ромбів, існує кілька видів. Але не всі вони рівні, і не у всіх типах клітин є потрібні вірусу протеази. А фурин якраз один з найефективніших, та ще й живе він не тільки на поверхні клітин, а й усередині. Найбільш наочно все небезпека нового фурінового сайту демонструє різниця між CoV2 і його "предтечею" SARS-CoV:
Як видно з діаграми, в разі CoV2, завдяки фуріновому сайту, розрізати його S білок поза клітиною можуть не два, а три класи протеаз (три різнокольорових Пакмена). Але, можливо, найважливіша різниця полягає в тому, що фурин присутній і всередині клітини, тому він може розрізати S білок відразу після складання віріона, тим самим підвищуючи здатність нових віріонів зливатися з іншими клітинами - так би мовити, не відходячи від каси.
До речі, існує ймовірність , що саме новий фуріновий сайт грає важливу роль в вираженою возрастозавісімой морбідності і летальності CoV2:
З невідомих причин, пацієнти з гіпертонією, діабетом, ішемічною хворобою серця, цереброваскулярні захворювання, хронічними обструктивними захворюваннями легень і нирковою дисфункцією мають гірші клінічні наслідки при інфікуванні SARS-CoV-2. Метою даного огляду є узагальнення доказів існування підвищеного плазмин (фібрину) а у пацієнтів з COVID-19 з цими коморбідних станами. Плазмін і інші протеази можуть розщеплювати новий фуріновий сайт в шиповидном білку SARS-CoV-2 внеклеточно, що збільшує його інфекційність і вірулентність.
Початковий текст
Пацієнти з гіпертонічною хворобою, діабетом, ішемічною хворобою серця, цереброваскулярними захворюваннями, хронічними обструктивними захворюваннями легенів та дисфункцією нирок мають гірші клінічні результати при інфікуванні ГРВІ-CoV-2 з невідомих причин. Мета цього огляду - узагальнити докази існування підвищеного плазміну (огену) у пацієнтів із COVID-19 із цими коморбідними станами. Плазмін та інші протеази можуть розщеплювати нещодавно вставлене місце фурину в S білку SARS-CoV-2 позаклітинно, що підвищує його інфекційність та вірулентність.
Ах, так, розрізає фурин білки в строго певних місцях, а саме після послідовності RxxR (тобто Arg-XX-Arg, де X може бути будь-який амінокислотою). При цьому якщо на другому або третьому місці теж аргінін (тобто RRxR або RxRR), то ефективність розщеплення цього сайту істотно зростає.
Тому поява нового furin cleavage site фахівцями було помічено одразу . Ще б! Адже такого сайту немає ні у кого з найближчих або навіть далеких родичів Cov2 - ті коронавіруси, у яких він є, лише на 40% близькі до Cov2 по геному:
Початковий текст
Було встановлено, що всі колоски з гомологією послідовності SARS-CoV-2 Spike більше 40% не мали місця розщеплення фуріна (рис. 1, таблиця 1), включаючи Bat-CoV RaTG13 та SARS-CoV (з ідентифікацією послідовності як 97,4 % та 78,6% відповідно). Місце розщеплення фуріна “RRAR” у SARS-CoV-2 є унікальним у своїй сім’ї, переданий унікальним вкладишем “PRRA”. Місце розщеплення фуріна SARS-CoV-2 навряд чи розвинулося з MERS, HCoV-HKU1 тощо. З наявних в даний час послідовностей в базах даних нам важко знайти джерело. Можливо, є ще багато проміжних еволюційних послідовностей, які очікують їх виявлення.
Ось наочна ілюстрація з тієї ж статті, що і Вищенаведена цитата (рожевим відзначені коронавіруси з фуріновим сайтом, на 10 годинах наведено 3 різні штами Cov2):
Найближчий родич з фуріновим сайтом - це штам HKU5, виділений командою Ши Чженлі в 2014 році в Гуанчжоу з кажанів роду Pipistrellus (розміщений в GenBank в 2018-му). Але родич він вельми далекий - їх шиповидні білки збігаються лише на 36%.
Загалом, вчені в замішанні. Звідки взялася ця вставка з 12 нуклеотидів? Чи може вона бути рукотворної? Цілком. Адже такими вставками вірусологи займалися багато разів, причому здавна. Наприклад, американці вставляли RRSRR в шіповідний білок першого SARS-CoV ще в 2006-му :
Початковий текст
Щоб дослідити, чи може відбутися протеолітичне розщеплення основних залишків амінокислот, полегшити активність синтезу клітин-клітин, ми мутували глікопротеїн дикого типу SARS-CoV для побудови прототипічного сайту розпізнавання фуріна (RRSRR) в будь-якому положенні.
А японці вставили такий сайт (RRKR) в білок SARS-CoV в 2008 році, правда трохи нижче за течією:
У тому ж 2008-му році їх голландські колеги теж вивчали ці протеазні сайти у SARS-CoV і порівнювали їх з мишачим коронавірусів MHV, у якого цей сайт є (SRRAHR | SV), причому схожий на сайт нашого CoV2 (SPRRAR | SV):
У 2009 році інша американська група теж вирішила повправлятися над "покращенням" SARS-CoV і, не змінюючи американської традиції не розмінюватися на дрібниці з аргініну, вони вставили RRSRR :
Початковий текст
Щоб вивчити потенційне використання SARS-CoV S1 – S2 та S2? позиціонуючи як сайти для протеолітичного розщеплення, вперше ми ввели сайти розпізнавання розщеплення фуріна в цих місцях, зробивши наступні мутації 664-SLLRSTSQSI - SLL RRSRR SI-671 (S1 – S2) та 792-LKPTKRSF - LKRTKRSF-799 (S2?).
Пекін-2019
Але грали останніми подібною роботою, яку я бачив, була робота жовтня 2019 року вчених з Пекіна, де новий фуріновий сайт RRKR вставили не в якійсь псевдовірус, а в справжнісінький курячий коронавірус, infectious bronchitis virus (IBV):
До речі, цікаво згадка авторів, що додавання фурінового сайту дозволяє вірусу-мутанту вражати нервові клітини. Бути може, саме фуріновий сайт CoV2 є причиною того, що деякі пацієнти з CoV2 демонструють неврологічну симптоматику , включаючи втрату нюху:
Мутація сайту S2 'шиповидного білка рекомбінантного вірусу генотипу QX призводить до більш високої патогенності, вираженим нервовим симптомів і нейротропізмом в порівнянні з курчатами, інфікованими вурусом дикого типу IBV (WT-IBV). У цьому дослідженні ми представляємо докази того, що рекомбінантний IBV з мутантним сайтом S2 (фуріновий сайт-S2) призводить до більш високої смертності. Зараження мутантом IBV викликає важкий енцефаліт і руйнує гематоенцефалічний бар'єр. ... Таким чином, наші результати демонструють, що фуріновий сайт перед FP в шиповидном білку є важливим сайтом для CoV, модулирующим проникнення, злиття клітин з вірусом, адаптацію до клітини-господаря, клітинний тропізм і патогенність, але не антигенность.
Початковий текст
Мутація S2 'сайту генотипу QX (типу QX) шипового білка (S) на тлі рекомбінантного вірусу призводить до більш високої патогенності, виражених нейронних симптомів та нейротропізму в порівнянні з умовами у курей, заражених IBV дикого типу (WT-IBV) . У цьому дослідженні ми наводимо докази, що рекомбінантний IBV з мутантним сайтом S2 (furin-S2 'сайт) призводить до вищої смертності. Інфекція мутантним ІVV викликає важкий енцефаліт і порушує гематоенцефалічний бар'єр. … Підсумовуючи результати, наші результати демонструють, що місце розщеплення фуріна вище за білок FP у білці S є важливим місцем для CoV, модулюючого введення, злиття клітин та вірусів, адаптацію до його клітини-господаря, тропізму клітин та патогенності, але не антигенності.
При цьому у багатьох коронавирусов фуріновие сайти, звичайно ж, зустрічаються в природі, і вони дуже різні. Та й з'являтися вони можуть і в результаті випадкових мутацій. Саме це сталося у випадку з MERS-му, про що в 2015 нам повідав міжнародний колектив авторів , серед яких були і Ши Чженлі, і Ральф Барік - дві зірки синтетичної коронавірусологіі. Про них ми ще неодноразово згадаємо, а поки пару слів про ту статті. Власне в ній автори показали дві ключові мутації, які дозволили MERS перескочити з кажанів на людину. І одна з цих мутацій призвела до виникнення фурінового сайту. Правда це була не врізка нових амінокислот, а мутації раніше існуючих (позначених червоним нижче):
Автори не просто показали, а прив'язали ці мутації назад до вихідного летучемишіному шиповидного білку, створивши в ньому ті ж самі мутації (тобто, і фуріновий сайт), і показавши, що це надає йому здатність заражати людські клітини:
Початковий текст
Для оцінки потенційних генетичних змін, необхідних для зараження людськими клітинами HKU4 , ми переробили шип HKU4, маючи на меті розробити його здатність опосередковувати потрапляння вірусів у клітини людини. З цією метою ми внесли дві одиночні мутації, S746R та N762A, у шип HKU4. Мутація S746R, як очікується, відновить мотив hPPC в шипі HKU4 , тоді як мутація N762A, ймовірно, порушила потенційне N-зв'язане місце глікозилювання в мотиві hECP в шипі HKU4. … Отже, реінжиніровані мотиви hPPC та hECP дозволили активізувати шип HKU4 ендогенними протеазами людини і тим самим дозволив псевдовірусам HKU4 обійти потребу в екзогенних протеазах потрапляти в клітини людини.Ці результати показують, що шипу HKU4 потрібно лише дві поодинокі мутації на кордоні S1 / S2, щоб отримати повну здатність опосередковувати потрапляння вірусу в клітини людини.
До речі, то як вони це зробили може людей далеких від сучасних біотехнологій налякати саме по собі - тому що автори вставили цей Коронавірусние шіповідний білок в інактивований ретровірус (ВІЛ):
Якщо коротко, псевдотіпірованние ретровіруси MERS-CoV-spike, які експресують репортерний ген люциферази, були отримані шляхом котрансфекціі клітин HEK293T плазмидой, несучої геном ВІЛ-1, дефектний по Env, експресуючий люціферази (pNL4-3.luc.RE-) і плазмидой, що кодує MERS -CoV шіповідний білок.
Початковий текст
Коротко, ретровіруси MERS-CoV-шип-псевдотипові, що експресують репортерний ген люциферази, готували шляхом котрансфекції клітин HEK293T плазмідою, що переносить дефіцитний вірусом ВІЛ-1, що експресує люциферазу (pNL4–3.luc.RE-), і кодує плазміду. Білок шипу MERS-CoV
Бути може, саме це спонукало індійських дослідників на пошук схожих у ВІЛ і CoV2 послідовностей в геномі (але їх препринт швидко розкритикували за невдалу методологію і помилкові висновки). Насправді такі псевдовіруси фахівці використовують регулярно, і взагалі, не варто огульно боятися ретровірусів як клас - їх підвид лентивіруси використовується для генної терапії вже багато років.
Звідки взявся RaTG13
Взагалі, RaTG13 - феноменальний штам. Дивно, що всі ці роки група Ши Чженлі про нього мовчала. Адже він зовсім не схожий на інших своїх побратимів, особливо в послідовності шиповидного білка, а це, нагадаю, саме те місце, яке визначає до яких типів клітин (і яких видів) даний вірус зможе чіплятися. Ось графік схожості генома CoV2 в порівнянні з іншими летучемишінимі коронавірусами (панель B):
RaTG13 - це червона крива, а синя - це найбільш близькі до RaTG13 штами (ZXC21 і ZC45). Ці штами були виділені з Китайських подковоносов ( Rhinolophus sinicus ) в Чжоушані в 2015 ( ZXC21 ) та 2017 років ( ZC45 ) роках. Як видно з графіка, навіть вони дуже сильно розходяться з RaTG13 (червона крива) в районі S білка. При цьому графік вище не так добре передає масштаб прірви між ними як пряме порівняння сіквенсів:
Як бачимо, шиповидні білки ZXC21 і ZC45 не тільки, в цілому, на 23-24 амінокислотних залишку коротше білка RaTG13, але вони коротші в найважливішому місці - в RBM (див. Делеции в червоному прямокутнику, відмічені червоними прочерками).
Так звідки ж взявся RaTG13? Як я вже сказав, у 2020 році Ши Чженлі повідомила, що виділила його у подковоносов (тільки виду Rhinolophus affinis , а не R. sinicus ) в липні 2013 року в Юньнані. Правда, до кінця січня 2020 року публічно про його існування не повідомлялося, а ось як описує своє знаменна відкриття про його схожості з CoV2 сама група Ши Чженлі :
Потім ми виявили, що короткий ділянку РНК-залежною РНК-полімерази (RdRp) від коронавируса кажана (BatCoV RaTG13), який раніше був виявлений у Rhinolophus affinis з провінції Юньнань, показав високу ідентичність послідовності 2019 CoV2. Ми провели повнорозмірне секвенування на цьому зразку РНК (реєстраційний номер GISAID EPI_ISL_402131). Аналіз Simplot показав, що 2019 CoV2 дуже схожий на RaTG13 (Fig. 1c), із загальною ідентичністю генома 96,2%.
Початковий текст
Потім ми з’ясували, що коротка область РНК-залежної РНК-полімерази (RdRp) від коронавірусу кажана (BatCoV RaTG13) - яка раніше була виявлена у Rhinolophus affinis з провінції Юньнань - виявила високу ідентичність послідовності до 2019-CoV2. Ми провели повнометражне секвенування на цьому зразку РНК (номер приєднання GISAID EPI_ISL_402131). Аналіз Simplot показав, що 2019-CoV2 був дуже схожий у геномі на RaTG13 (рис. 1в), із загальною ідентичністю послідовності геномів 96,2%.
Не густо: ну був у них цей штам «раніше виявлений» , і був. Лежав на полиці. До 2020 року секвенували в ньому тільки частина генома, що відповідає за RdRp. Звідки він на полиці взявся? У Юньнані в 2013 році виділили. Де саме? Чи не сказали. У GenBank теж не було цієї інформації. Але, на щастя, в базі геномів GISAID була: повідомляється, що в місті Пуер (так, на батьківщині улюбленого чаю Басти) його виділили з fecal swab нікого самця:
Кажани були захоплені з різних місць у п'яти графствах чотирьох префектур провінції Юньнань, Китай, з травня по липень 2013 року.
У тій експедиції нічого особливо цікавого для нас дослідники не знайшли, але, можливо, саме тоді Ши Чженлі (або хтось із її групи?) Виділив той самий зразок RaTG13? Який вони секвенували лише частково, але чомусь вирішили не публікувати, хоча він дуже відрізнявся від усього відомого раніше.
Сама Ши Чженлі цілком могла особисто брати участь в тій експедиції, тому що про таких експедиціях вона відгукувалася дуже тепло - наприклад, в своєму TED-like виступі в 2018 році, де вона показувала свої фотографії з таких експедицій:
Саме серія таких експедицій і принесла їй світову славу і прізвисько «Бетвумен»: у 2013 році в статті в Nature група Ши Чженлі тріумфально оголосила про те, що в печерах Юньнани вона виявила кажанів-носіїв штамів RsSHC014 і Rs3367, які збігалися з першим SARS -CoV на 85% і 96% відповідно.
До речі, цікавий збіг, що приблизно в той же час, в тій же Юньнани група Ши Чженлі, виявляється, також виявила і штам RaTG13, який виявився найбільш близький до CoV2, і їх геноми теж збігаються на 96%.
«Ухань-1»
Повертаючись до тієї тріумфальної статті від 2013 року, в ній же група Ши Чженлі ще розповіла, що за допомогою культивування виділених зразків в культурі мавпячих клітин Vero , їм вдалося виділити живий вірус, який був практично ідентичний штаму Rs3367 (найбільш близького до SARS-CoV) . Своє дітище автори охрестили WIV1 (де WIV позначає Wuhan Institute of Virology):
Що найбільш важливо, ми повідомляємо про першу ізоляції живого вірусу SL-CoV (летучемишіний SL-CoV-WIV1) із зразків, виділених з фекалій кажана, в клітинах Vero E6, який має типову морфологію коронавируса, ідентичність генома на 99,9% з Rs3367 і використовує ACE2 людей, Росса і подковоносов для проникнення в клітину. Попереднє тестування in vitro показує, що WIV1 також має широкий видовий тропізм.
Початковий текст
Найголовніше, що ми повідомляємо про перше зафіксоване виділення живого SL-CoV (кажана SL-CoV-WIV1) з фекальних зразків кажана в клітинах Vero E6, який має типову коронавірусну морфологію, 99,9% ідентичність послідовностей до Rs3367 і використовує ACE2 від людини, циветки і китайські підкови для введення в клітину. Попередні випробування in vitro свідчать, що WIV1 також має широкий вигляд тропізму.
Давайте порівняємо RaTG13 зі штамами Rs3367 і RsSHC014: Як бачимо, шіповідний білок цих штамів не тільки коротше RaTG13-шного на 13 амінокислот, але і сильно відрізняється він нього в першій його чверті. До речі, цікаво, що шиповидні білки у Rs3367 (aka WIV1) і RsSCH014 практично ідентичні, і розрізняються тільки в районі RBD (правий сиквенс нижче). Майже як CoV2 і RaTG13 (не рахуючи фуріновой врізки):
Чи міг який-небудь дослідник, отримавши в березні 2019 го зразки коронавируса з конфіскованих митницею панголінів, захотіти перевірити, наскільки панголіни RBM тропен до людського рецептора? А якщо ще й з polybasic фуріновим сайтом в найцікавішому місці? Ось це буде бомба!
Теоретично, звичайно, міг би. Нічого технічно складного для вірусологів в здійсненні таких експериментів немає. Резонне питання: а навіщо їм для цього використовувати RaTG13 в якості основи, а не вже випробуваний WIV1? Але цілком можливо, що химеру з WIV1 вони теж тестували. А паралельно вирішили змоделювати варіант рекомбінації панголіни вірусу з більш близьким йому летучемишіним - адже RaTG13 все ж ближче до панголіни штамів ніж WIV1: його шіповідний білок ближче до них і філогенетично, і структурно - він з ними навіть по довжині збігається, в той час як білки WIV1 / Rs3367 і RsSHC014 на 13 амінокислот коротше панголіни. Та й загальна для RaTG13 і панголіни-19 (MP789) мутація QTQTNS в районі протеазний сайту не може залишити байдужою фахівця.
Інші Юньнаньськоє штами
До речі, інші дослідники в 2011 році теж знаходили зразки коронавірусів у Юньнаньськоє Rhinolophus affinis Сама цікавим мені видався штам LYRa11:
Але і він дуже далекий від RaTG13, а куди ближче до Rs3367 (це той штам, що на 96% збігається з першим SARS-CoV):
А ось RaTG13, виділений з тих же кажанів Rhinolophus affinis , що і LYRa11, на нього схожий найменше (лівий бласт).
Ну і нарешті, ще один Юньнаньськоє штам (нехитро названий Yunnan2011), виділений в 2011 році з іншого підвиду подковоносов, Rhinolophus pusillus , схожий на RaTG13 ще менше ніж LYRa11:
Та й між собою Yunnan2011 і LYRa11 (правий бласт вище) не особливо схожі, не рахуючи висококонсерватівную область S2. До речі, що за бардак у них з назвами штамів? Те повністю рік прописують, то частково, а то й зовсім немає (Rs3367). Те спочатку йде вид носія ( Ra TG13), то потім (LY Ra 11). Ще ось цікаво, що позначають TG, LY або SHC? Ініціали розшифрував геном?
Гаразд, перейдемо вже від вірусної археології до вірусної інженерії, а саме до пересадки ключових ділянок шиповидного білка і іншим gain-of-function (GOF) експериментів.
1999: Перший химерний коронавірус
Eсли ви думаєте, що вся ця GOF-двіжуха з аналізом того, що саме дозволяє коронавірусу перестрибувати з одного виду на інший почалася у відповідь на епідемію першого SARS-а в 2002 році, ви помиляєтеся. Вірусологи експериментували з химерними коронавірусами задовго до цього. Ось, наприклад, показова стаття від 1999 року від голландської групи Пітера Роттіера з Утрехта з промовистою назвою "Ретаргетінг коронавируса шляхом заміни ектодомена в шиповидном білку: перетин видового бар'єру":
Початковий текст
Використовуючи цільову рекомбінацію РНК, ми сконструювали мутант вірусу гепатиту коронавірусу миші (MHV), в якому ектодомен шипового глікопротеїну (S) був замінений на сильно розбіжну ектодомену S білка вірусу котячого інфекційного перитоніту. Отриманий химерний вірус, позначений fMHV, набув здатності заражати котячі клітини і одночасно втрачав здатність заражати мишачі клітини в культурі тканин.
До речі, схоже, що Ши Чженлі стажувалося під керівництвом Пітера Роттіера в Утрехті. По крайней мере, в 2005-му вона була в співавторів спільної статті , де Утрехт був вказаний як її афіліації (але поточний адресу був уже зазначений в Шанхайському інституті). До речі, сама стаття теж вельми цікава - в ній автори досліджували що саме дозволяє вірусам розширювати свій видовий тропізм:
Початковий текст
Лише відносно небагато мутацій у його шипоподібному білку дозволяють коронавірусу миші переходити з обмеженого мишачим тропізмом у розширений діапазон господаря шляхом проходження in vitro. Один з таких вірусів, який ми вивчали, придбав два ймовірні сайти, що зв'язують гепаран сульфат , зберігаючи інший сайт у мотиві розщеплення фуріна .
По-перше, цікаво, що фуріновий сайт в тому вірусі (SRRAHR | SV) схожий на сайт в CoV2 (SPRRAR | SV), хоча у CoV2 він ріжеться більш ефективно через здвоєних аргінін (це і робить його polybasic сайтом, тобто у нього в послідовності RxxR кілька основних амінокислот поспіль):
Але особливо стаття цікава тим, що мутації, які дозволяли вірусу "розширити свій кругозір", відбулися навіть не в лабораторних тварин, а в пробірці ( by being passaged in vitro ). Причому, схоже, відбувалися вони досить швидко:
Початковий текст
MHV / pi23, вірус, отриманий після 23 з 600 пасажів, які призвели до MHV / BHK, також містить передбачуваний HS-зв'язуючий сайт в домені S1 в тому ж положенні, що і в MHV / BHK, хоча і як менша вставка, хоча він не вистачає передбачуваного HS-зв'язуючого ділянки безпосередньо перед потоком злитого пептиду. MHV / pi23 дійсно заражає немуринові клітини, але набагато менш ефективно, ніж MHV / BHK. Крім безлічі сайтів, що зв'язують HS, проте мутації, виявлені в інших частинах білка S, такі як домен HR1 та пектид певного злиття (рис. 1), також можуть сприяти ефективному потраплянню в немуринові клітини. Наразі ми перебуваємо в процесі визначення мутацій S білка, необхідних для фенотипу розширеного діапазону господаря.
Забігаючи вперед, згадаю, що були й інші групи, які намагалися мутаціями в пробірці збільшити вірулентність коронавируса, наприклад MERS-а:
Початковий текст
Щоб краще зрозуміти пристосованість видів MERS-CoV, ми визначили неоптимальний варіант DPP4 для походження видів для вивчення вірусної адаптації. Пасирування вірусу на клітинах, що експресують цей варіант DPP4, призвело до накопичення мутацій у вірусному шипі, що посилило реплікацію.
Причому у них мутації виникали вже через кілька пасажів (раундів розмноження клітинних культур):
(F) Схема появи одиночних і подвійних мутацій в шиповидном білку MERS-CoV в різних пасажах. (G) Розташування мутацій в шиповидном білку MERS-CoV.
Початковий текст
(F) Схематичне виникнення одинарних та подвійних мутацій у шипі MERS-CoV на різних пасажах. (G) Розташування мутацій у шипі MERS-CoV.
Але це все буде набагато пізніше. А поки давайте повернемося в 2002 рік - ще ДО спалаху першого SARS-CoV.
Як Барік всім шлях осяяв
Ральф Барік - це людина-легенда в коронавірусологіі. Справжній першопроходець синтетичних методик маніпуляції вірусних геномів. Ще в 2002 році він опублікував проривних роботу, яка відкрила нову віху як у вивченні різних механізмів природних вірусів, так і в gain-of-function (GOF) дослідженнях. У своїй роботі група Баріка синтетично відтворила клон природного мишачого коронавируса:
Був розроблений новий метод складання повнорозмірною інфекційної кДНК штаму вірусу гепатиту миші коронавируса II групи А59 (MHV-A59). Були виділені сім сегментів кДНК, які охоплювали весь геном MHV розміром 31,5 тисяч пар нуклеотидів. Кінці кДНК були сконструйовані з унікальними стиками і зібрані тільки з сусідніми субклонов кДНК, в результаті чого була отримана интактная конструкція кДНК MHV-A59 довжиною ~ 31,5 т.п.н. Сайти рестриктаз в місцях стиків, які розташовувалися на кінцях кожного сегмента кДНК, систематично віддалялися в процесі побудови повного повнорозмірного продукту кДНК, що дозволяє проводити повторну збірку без внесення нуклеотидних змін ... Цей метод потенційно може бути використаний для конструювання вірусних, мікробних або еукаріотичних геномів,
Початковий текст
Розроблено новий метод для збирання повнорозмірної інфекційної кДНК штаму A59 вірусу гепатиту коронавірусу миші групи II (MHV-A59). Виділено сім суміжних клонів кДНК, які охоплювали MHV геном 31,5-кб. Кінці кДНК були сконструйовані унікальними з'єднаннями і зібрані лише сусідніми підклонами кДНК, в результаті чого отримала недоторкану конструкцію кДНК MHV-A59 довжиною? 31,5 кб. З'єднувальні між собою з'єднання рестрикційних вузлів, розташовані на кінцях кожної кДНК, систематично видаляються під час складання повного продукту кДНК повної довжини, дозволяючи повторно збирати без внесення нуклеотидних змін… Метод може використовуватись для побудови вірусного, мікробний,
Тобто автори, по суті, перевели РНК-вірус на мову ДНК (за допомогою зворотної транскриптази), для того щоб потім їм було зручно маніпулювати його геномом за допомогою наявних інструментів генної інженерії. Створивши 7 таких cDNA сегментів провируса, автори потім їх зшили, причому «бесшовно» (не залишаючи слідів), після чого перевели свою конструкцію назад в РНК, з якої потім в інших клітинах сформувалися вірусні частинки.
ГРВІ-2003
Буквально через кілька тижнів після публікації тієї роботи групи Баріка грянула епідемія SARS-CoV, і Ральф Барік не втрачав часу дарма. Уже влітку 2003 його група відправила до друку роботу зі створення синтетичного клону SARS-CoV:
Використовуючи набір суміжних сегментів кДНК, які охоплюють весь геном, ми зібрали повнорозмірну кДНК штаму SARS-CoV Urbani і виділили синтетичні клони віруси SARS (інфекційний клон SARS-CoV), які містили очікувані маркерні мутації, вставлені в клони. Рекомбінантні віруси реплицироваться так само ефективно, як вірус дикого типу, і обидва були інгібіровані обробкою інгібітором цістеінпротеінази ... Наявність повнорозмірною кДНК SARS-CoV створює інструмент для маніпулювання вірусним геномом, дозволяючи швидко і раціонально розробляти і тестувати кандидати вакцин і терапевтичних засобів проти цього важливого людського патогена .
Початковий текст
За допомогою панелі суміжних кДНК, що охоплюють весь геном, ми зібрали кДНК повної довжини штаму Урбані SARS-CoV і врятували молекулярно клоновані віруси SARS (інфекційний клон SARS-CoV), які містили очікувані мутаційні маркери, вставлені в компонентні клони. Рекомбінантні віруси реплікувалися так само ефективно, як вірус WT, і обидва інгібувались лікуванням інгібітором протеїнази цистеїну… Наявність повноцінної кДНК SARS-CoV забезпечує шаблон для маніпулювання вірусним геномом, що дозволяє швидко та раціонально розвивати та тестувати вакцини та терапевтичні засоби проти цього важливого збудника людини.
Швидкість групи Баріка дозволяє зрозуміти, як швидко кваліфікована команда вірусологів може створити синтетичний клон з природного вірусу, а значить і вносити в нього генетичні модифікації. Причому це було в 2003 році. Сьогодні все те ж саме кваліфікована лабораторія може повторити за лічені тижні.
ГРВІ-2006
Барік був першим, але далеко не останнім. Генна інженерія розвивалася семимильними кроками, створюючи все нові і нові інструменти. Інші групи відпрацьовували альтернативні технології синтетичної вірусології. Наприклад, в 2006 іспанські дослідники повторили досягнення Баріка, теж створивши синтетичний клон SARS , але за допомогою іншої технології ( штучної бактеріальної хромосоми ):
Початковий текст
У цьому дослідженні описана інженерія повнорозмірного інфекційного клону кДНК та функціонального реплікона важкого коронавірусу гострого респіраторного синдрому (SARS-CoV) штаму Урбані як бактеріальної штучної хромосоми (BAC). У цій системі вірусна РНК експресувалася в клітинному ядрі під контролем промотору цитомегаловірусу і додатково ампліфікувалась у цитоплазмі вірусною реплікацією. І інфекційний клон, і репліксон були повністю стійкими в кишці. … Створений інфекційний клон SARS-CoV кДНК був повністю стабільним під час його розмноження в клітинах E. coli DH10B протягом більше 200 поколінь, що значно полегшило генетичну маніпуляцію вірусним геномом (дані не показані). Детальна стратегія клонування, карти плазміди та послідовності доступні за запитом.
Правда, зробили вони це не так елегантно як Барік, так як в фінальне складання синтетичного вірусу у них залишилися додані сайти рестриктаз, в той час як Барік навчився поєднувати фрагменти «бесшовно». Але це дрібниці, підхід іспанців теж цілком робочий - в 2013 році з його допомогою вони створили синтетичний клон MERS-a , а в 2015 році їх методика увійшла в підручник-довідник по коронавірусу (глава 13):
Ухань-2007
Але повернемося в 2007 рік. Тоді в гонку синтетичної вірусології включилася і група Ши Чженлі з роботою, яка вивчала шіповідний білок людського і летучемишіного коронавірусів, намагаючись визначити, що саме в ньому відповідає за здатність перескакувати з виду на вид:
Початковий текст
Серія S-химер була побудована шляхом вставки різних послідовностей SARS-CoV S у магістраль SL-CoV S.
Тобто автори вставляли різні відрізки з білка людського SARS-CoV в білок летучемишіного вірусу. Ось їх висновок:
Початковий текст
З цих результатів було зроблено висновок, що область від aa 310 до 518 BJ01-S була необхідною і достатньою для перетворення Rp3-S в молекулу, що зв'язує huACE2.
При цьому вони намагалися заміняти і більш короткі фрагменти, включаючи тільки RBM:
Початковий текст
Для введення RBM SARS-CoV S в SL-CoV S, область кодування від aa 424 до 494 BJ01-S була використана для заміни відповідних областей Rp3-S, в результаті чого з'явився химерний ген S (CS) позначено CS424–494.
З урахуванням того, що це було написано в 2007 році, думаю, сьогодні провести заміну RBM одного вірусу на інший не складе труднощів навіть початківцю вірусологу.
Химера-2015
У світлі вищеописаних експериментів, не дуже зрозуміло, чому саме був викликаний той фурор, яка справила, мабуть, найгучніша gain-of-function публікація. Мова, звичайно ж, про спільну роботу Ши Чженлі і Ральфа Баріка, в якій вони створили синтетичний химерний вірус:
Використовуючи систему зворотного генетики SARS-CoV, ми створили і охарактеризували химерний вірус, експресуючий шіповідний білок коронавируса кажана SHC014 в мишіноадаптірованной основі SARS-CoV. Результати показують, що віруси групи 2b, які кодують шіповідний білок SHC014 в основі дикого типу, можуть ефективно використовувати кілька Ортолог людського рецептора SARS (ACE2), ефективно реплицироваться в первинних клітинах дихальних шляхів людини і досягати титрів in vitro, еквівалентних епідемічним штамів SARS-CoV. Крім того, експерименти in vivo демонструють реплікацію химерного вірусу в легенях миші з помітним патогенезом. Оцінка доступних иммунотерапевтических і профілактичних методів на основі атипової пневмонії показала низьку ефективність; підходи як до моноклональних антитіл, так і до вакцин не змогли нейтралізувати і захистити від інфікування CoV з новим шиповидного білком. На підставі цих результатів ми синтетично відтворили інфекційний повнорозмірний рекомбінантний вірус SHC014 і продемонстрували реплікацію вірусу як in vitro, так і in vivo.
Початковий текст
Використовуючи систему зворотної генетики SARS-CoV, ми створили та охарактеризували химерний вірус, що експресує шип коронавірусу кажана SHC014 у пристосованій мишею магістралі SARS-CoV. Результати вказують на те, що віруси групи 2b, що кодують шип SHC014 в магістралі дикого типу, можуть ефективно використовувати численні ортологи рецептора ангіотензину, що перетворюють людський ангіотензин II (ACE2) рецептора SARS, ефективно реплікувати в первинних клітинах дихальних шляхів людини та досягати титрів in vitro, еквівалентних епідемічним. штами SARS-CoV. Крім того, експерименти in vivo демонструють реплікацію химерного вірусу в легені миші з помітним патогенезом. Оцінка наявних імунотерапевтичних та профілактичних методів на основі ГРВІ виявила низьку ефективність; як моноклональні антитіла, так і вакцинні підходи не змогли нейтралізувати та захистити від зараження CoV, використовуючи новий протеїн шип. На основі цих висновків ми синтетично повторно отримали інфекційний повнокомплектний вірус SHC014 і продемонстрували стійку вірусну реплікацію як in vitro, так і in vivo.
Тобто, по суті, дослідники йшли вже второваною дорогою: взяли шіповідний білок з RsSHC014, який Ши Чженлі виділила з Юньнаньськоє кажанів в 2011 році, і вставили його в SARS-CoV, спеціально адаптований під народжених повзати мишей, для подальших in vivo експериментів на цих самих мишах. Ну і на людських клітинах нову конструкцію перевірили. А заодно поупражнялись в створенні рекомбінантного клону того ж самого RsSHC014 - ну а чому б і ні? Адже, по-перше, це красиво:
(A) Схема молекулярного клону SHC014-CoV, який був синтезований у вигляді шести суміжних сегментів кДНК (позначених як SHC014A, SHC014B, SHC014C, SHC014D, SHC014E і SHC014F), фланкирован унікальними рестріктазного сайтами BglI, які забезпечили спрямовану збірку повнорозмірною експресії кДНК (для 1a, 1b, спайка, 3, конверт, матриця, 6-8 і нуклеокапсид). Підкреслені нуклеотиди є виступаючі послідовності, утворені після розщеплення рестриктазой.
Початковий текст
(a) Схематичний молекулярний клон SHC014-CoV, який був синтезований у вигляді шести суміжних кДНК (позначених SHC014A, SHC014B, SHC014C, SHC014D, SHC014E та SHC014F), поєднаних унікальними BglI-сайтами, які дозволяли направляти збірку повнорозмірної експресії кДНК відкриті рамки зчитування (для 1а, 1b, шип, 3, конверт, матриця, 6–8 та нуклеокапсид). Підкреслені нуклеотиди являють собою надвисочні послідовності, що утворилися після розщеплення рестрикційного ферменту.
А по-друге, дослідники зрозуміли, що не тільки тропностью шиповидного білка до рецептора визначається потенціал вірусу до переходу з одного виду тварин на інший - тому що химера SHC014-MA15 була більш вирулентной ніж сам SHC014, навіть в людських клітинах:
Примітно, що диференційний тропізм легких у порівнянні з таким у SARS-MA15 і ослаблення повнорозмірного SHC014-CoV в культурах [епітеліальних дихальних шляхів людини] щодо SARS-CoV Urbani дозволяють припустити, що крім зв'язування з ACE2 і інші чинники - включаючи процессівность шиповидного білка , біодоступність рецептора або антагонізм імунних відповідей господаря - можуть сприяти вірулентності.
Початковий текст
Зокрема, диференціальний тропізм легені порівняно з аналогічним показником SARS-MA15 та ослаблення повноцінної SHC014-CoV в культурах [клітини епітеліальних дихальних шляхів людини] відносно SARS-CoV Urbani припускають, що фактори, що перебувають поза зв'язуванням з АСЕ2, включаючи спайкову активність , рецептор біодоступність або антагонізм імунних реакцій господаря - може сприяти появі.
Особливо хочу виділити процессівность шиповидного білка в цитаті, тому що це далеко не перший раз коли дослідники писали, що здатність шиповидного білка до розщеплення протеазами (включаючи фурин) значно впливає на вірулентність.
На закінчення теми - спільне фото Ральфа Баріка і Ши Чженлі. Фото зроблено в Ухані, в жовтні 2018 го:
Мишачий SARS-2007
Тут не можу не згадати, що це був за "мишачий вірус MA15" в попередній роботі. Це зовсім не якийсь природний мишачий коронавірус, як можна було б припустити. А це лабораторно модифікований людський SARS-CoV, який ще в 2007-му та ж група Баріка - мабуть змагаючись з групою Ши Чженлі (пам'ятаєте їх статтю від 2007 року) - перетворила на справжнього мишачого вбивцю . Для цього вони його спочатку итеративно "покращували" на мишах, а коли він через декілька ітерацій став максимально "ефективним", вони відтворили виникли в мишах мутації в синтетичному клон нового вірусу, і ще раз перевірили, що він дійсно має підвищену инфективности:
Ми адаптували SARS-CoV (штам Urbani) шляхом серійного пассірованія в дихальних шляхах молодих мишей BALB / c. П'ятнадцять пасажів привели до вірусу (MA15), який є летальним для мишей після интраназальной инокуляции. Смертельний передує швидка реплікація вірусу з високим титром в легких, виремия і поширення вірусу на позалегеневий ділянки, що супроводжуються лимфопенией, нейтрофілією і патологічними змінами в легенях. Рясний вірусний антиген широко поширений в епітеліальних клітинах бронхів і альвеолярних пневмоцитах, а некротичний клітинний дебрис присутній в дихальних шляхах і альвеолах з легким і вогнищевим пневмонітом. Ці спостереження показують, що миші, інфіковані МА15, вмирають від переважної вірусної інфекції з великим, опосередкованим вірусом руйнуванням пневмоцитов і реснитчатих епітеліальних клітин.при введенні в рекомбінантний SARS-CoV ці мутації призводять до високовірулентні і летального вірусу (rMA15) , який дублює фенотип біологічно отриманого вірусу MA15. Интраназальная щеплення МА15 відтворює багато аспектів захворювання, які спостерігаються в важких випадках SARS у людини.
Початковий текст
Ми адаптували SARS-CoV (штам Урбані) шляхом послідовного проходження в дихальні шляхи молодих мишей BALB / c. П'ятнадцять пасажів спричинили смерть вірусу (МА15), смертельного для мишей після інтраназальної щеплення. Летальності передує швидка і високотитрова реплікація вірусу в легенях, віремія та поширення вірусу на позалегеневі ділянки, що супроводжуються лімфопенією, нейтрофілією та патологічними змінами в легенях. Багатий вірусний антиген широко поширений в епітеліальних клітинах бронхів та альвеолярних пневмоцитах, а некротичні клітинні уламки присутні в дихальних шляхах та альвеолах, мають лише легкий та вогнищевий пневмоніт. Ці спостереження говорять про те, що миші, заражені MA15, помирають від переважаючої вірусної інфекції з великим, вірусно опосередкованим руйнуванням пневмоцитів та війкових епітеліальних клітин.при введенні в рекомбінантний SARS-CoV ці мутації призводять до отримання високо вірулентного та летального вірусу (rMA15) , що дублює фенотип біологічно похідного вірусу MA15. Внутрішньозаразне прищеплення МА15 відтворює багато аспектів захворювання, що спостерігаються у важких випадках захворювання на ВРВІ у людини.
Барик-2008
До речі, про суперництво Баріка і Ши Чженлі. Паралельно з пересадкою RBD від людського SARS-CoV в мишачий, його група створювала такі ж химери і з летучемишінимі штамами. У 2008 році група Баріка взяла летучемишіний штам Bat-SCoV і замінила в ньому RBD в шиповидном білку на RBD з людського SARS-а. Тобто, по суті, повторила роботу Ши Чженлі від 2007 року, тільки не обмежившись псевдо-вірусами, а створивши справжнісінький химерний коронавірус - причому не якийсь мишачий як в роботі 2015 року, а самий що ні на є людський. Своїм досягненням автори явно пишалися:
Тут ми повідомляємо про розробку, синтезі і виділенню найбільшої синтетичної реплицирующейся життєвої форми розміром 29,7 кілобаз - коронавируса кажана (Bat-SCoV), подібного важкого гострого респіраторного синдрому (SARS), ймовірного попередника епідемії SARS-CoV. ... Щоб перевірити, чи є RBDs Bat-SCoV і SARS-CoV взаємозамінними, ми замінили RBD Bat-SCoV (амінокислоти 323-505) на RBD SARS-CoV (амінокислоти 319-518) (27, 28) (GenBank реєстраційний номер FJ211860) , що імітує теоретичну рекомбінацію, яка може статися під час змішаної інфекції in vivo (Fig. 1B).
Початковий текст
Тут ми повідомляємо про розробку, синтез та відновлення найбільшої форми життєдіяльності синтетичного реплікації, коронавірусу, схожого на важкий респіраторний синдром 29,7-фунтових кілограмів (ГРВІ), імовірного геногенної епідемії SARS-CoV. … Щоб перевірити, чи були RBDs Bat-SCoV та SARS-CoV взаємозамінними, ми замінили Bat-SCoV RBD (амінокислота 323–505) на SARS-CoV RBD (амінокислота 319–518) (27, 28) ( Номер приєднання GenBank № FJ211860), імітуючи теоретичну подію рекомбінації, яка може статися під час змішаної інфекції in vivo (рис. 1В).
(B) Схематичне зображення, що показує організацію шіповідних білків SARS-CoV і Bat-SCoV. Спроектовані білки зображені нижче з назвою вірусу зліва. Bat-SRBD включає всю послідовність шиповидного білка Bat-SCoV, за винятком того, що RBD Bat-SCoV (амінокислоти Bat-SCoV 323-505) замінений на RBD SARS-CoV (амінокислоти 319-518) (інвентарний номер GenBank FJ211860). Bat-SRBD-MA включає зміну RBD в шиповидном білку MA15 на SARS-CoV Y436H. Bat-SRBM включає мінімальні 13 залишків SARS-CoV, критичних для контакту з ACE2, що призводить до химерного RBD з амінокислотами 323I-429T Bat-SCoV і амінокислотами 426R-518D SARS-CoV. Bat-Hinge є послідовність Bat-SRBM, де амінокислоти Bat-SCoV 392L-397E замінені на амінокислоти SARS-CoV 388V-393D. Bat-F включає нуклеотидну послідовність 1-24057 SARS-CoV (до амінокислоти 855 в шиповидном білку) з залишилася 3'-послідовністю з Bat-SCoV. Праворуч від схематичних зображень вказані спостерігаються дані по транскрипционной активності і приблизні титри на 1-му пасажі (P1). ND вказує, що інфекційний вірус не виявлений.
Початковий текст
( B ) Схематичне зображення, що показує організацію білків SARS-CoV та Bat-SCoV Spike. Створена білками Спайк зображена нижче з назвою вірусу зліва. Bat-SRBD включає всю послідовність Bat-SCoV Spike, за винятком того, що Bat-SCoV RBD (Bat-SCoV амінокислота 323–505) замінено на SARS-CoV RBD (амінокислота 319–518) (приєднання GenBank № FJ211860). Bat-SRBD-MA включає зміну RBD MAX Spike на SARS-CoV aa Y436H. Bat-SRBM включає в себе мінімальні 13 залишків SARS-CoV, критичні для контакту з ACE2, внаслідок чого утворюється химерний RBD амінокислоти 323I-429T Bat-SCoV та амінокислоти 426R-518D SARS-CoV. Бат-шарнір - це послідовність Bat-SRBM, амінокислота Bat-SCoV 392L-397E замінена на амінокислоту SARS-CoV 388V-393D. Bat-F включає nt 1–24057 SARS-CoV (до амінокислоти Spike 855), а решта 3? послідовність від Bat-SCoV. Праворуч від схематичних зображень вказується спостереження за транскрипційною активністю та приблизними титрами запасів при проходженні 1 (P1). ND вказує на відсутність інфекційного вірусу, виявленого методом нальоту.
Барик-2016
У творчості Баріка взагалі багато рімейків. Наприклад, в 2016-му році він практично повторив ту саму спільну роботу з Ши Чженлі від 2015 року з створенню химерного вірусу, тільки на цей раз він вставив в мишіноадаптірованний SARS шматок шиповидного білка не з RsSCH014, а з іншого знайденого Ши Чженлі в Юньнані його близького родича - Rs3367. Ну або, якщо бути зовсім точним, то з штаму WIV1 - лабораторного клону Rs3367, вирощеного в клітинній культурі в Уханьского інституті вірусології в 2013 році. Ось що саме зробила в 2016 році група Баріка:
Використовуючи інфекційний клон SARS-CoV як матрицю (7), ми розробили і синтезували повнорозмірний інфекційний клон WIV1-CoV, що складається з шести плазмід, які можна було б ферментативно розрізати, лігувати разом і електропоріровать в клітини, для отримання репликационная компетентних віріонів (рис . S1A). На додаток до полноразмерному клону ми також створили химерний вірус WIV1-CoV, який замінив шіповідний білок в SARS на білок з WIV1 в адаптованій для миші основі (WIV1-MA15, рис. S1B). ... Для підтвердження кінетики росту і реплікації клітини Vero були інфіковані SARS-CoV Urbani, WIV1-MA15 і WIV1-CoV.
Початковий текст
Використовуючи інфекційний клон SARS-CoV як макет (7), ми розробили та синтезували повнорозмірний інфекційний клон WIV1-CoV, що складається з шести плазмід, які можна було ферментативно розрізати, зв’язати та електропорувати у клітини для порятунку реплікації компетентного потомства віріони (рис. S1A). На додаток до повнорозмірного клону, ми також виробили химерний вірус WIV1-CoV, який замінив шип SARS на шип WIV1 у межах миші, адаптованої до миші (WIV1-MA15, рис. S1B). … Для підтвердження кінетики росту та реплікації клітини Vero заражали SARS-CoV Urbani, WIV1-MA15 та WIV1-CoV.
Тобто, за великим рахунком, в 2016 році Барік клонував свою статтю від 2015 року. Більш того, вона має сенс мені не дуже зрозумілий: адже WIV1 / Rs3367, якщо пам'ятаєте, і так на 96% співпадав з SARS-CoV (за це Ши Чженлі і здобула популярність). Тому навіщо назад в SARS-CoV вставляти шіповідний білок з його найближчого родича мені не дуже ясно. Бути може, просто з любові до мистецтва. У цьому світлі заголовок його статті набуває певної подвійність: "SARS-подібний WIV1-CoV готовий до переходу на людину" . Чомусь в голову відразу приходить цей кадр:
Ще мені не зрозуміло як в 2015 році Барік зумів отримати патент на створення «химерних коронавірусних шіповідних білків», з урахуванням того, що все це і він, і Ши Чженлі публікували задовго до 2015-го.
Барик-1990
Гаразд, останній штрих до портрету Ральфа Баріка. Він не просто старожил цій галузі, а займався дизайном рекомбінантних коронавирусов ще до всяких сіквенатори і інших сучасних інструментів генної інженерії. Ось його стаття по створенню "температурних мутантів" з мишачого коронавируса від аж 1990-го року:
Протягом усього цього дослідження використовували штам вірусу гепатиту миші A59 (MHV-A59). Вірус розмножували і клонували три рази в безперервної клітинної лінії астроцитоми миші (DBT). ... Різні комбінації температурно-чутливих мутантів змішували і інокулював в клітини при множинності зараження, що дорівнює 10.
Початковий текст
Штам A59 вірусу гепатиту миші (MHV-A59) використовувався протягом всього дослідження. Вірус розмножували та клонували тричі у безперервній клітинній лінії астроцитоми миші (DBT). … Різні комбінації ts мутантів змішувались та прищеплювались до клітин при множинності інфекції по 10 кожна.
Так що створенням різних вірусних мутантів Барік займається вже понад 30 років.
Барик-2019
І, до речі кажучи, навіть зараз темпів не знижує. В кінці жовтня 2019 го його група подала на публікацію чергову статтю про важливу роль фурінового сайту в шиповидном білку для подолання коронавірусами «бар'єру для зоонозної інфекції»:
Разом ці результати демонструють, що протеазний розщеплення також є основним бар'єром для інфекції клітин Vero за допомогою HKU5-CoV. Розглядаючи далі, ми порівняли їх давніше казали розщеплення на кордоні S1 / S2, S2 'і сайті ендосомной цістеінового протеази в шіповідних білках MERS, PDF2180 і HKU5 (Fig. 6D) (26). У сайті S1 / S2 MERS, Uganda і HKU5 підтримують сайт розщеплення RXXR, хоча різні внутрішні амінокислоти можуть впливати на його ефективність. Для послідовності S2 'MERS і HKU5 також зберігають мотив RXXR; проте в шипах штаму Uganda відсутня перший аргінін (SNAR), що потенційно впливає на його розщеплення.
Початковий текст
Разом ці результати демонструють, що розщеплення протеази є також основним бар'єром на шляху зараження клітин Vero HKU5-CoV. Досліджуючи далі, ми порівняли передбачуване розщеплення на межі S1 / S2, S2 'та місця ендосомної цистеїнової протеази на шипах MERS, PDF2180 та HKU5 (рис. 6D) (26). Для сайту S1 / S2 MERS, Уганда та HKU5 підтримують мотив розщеплення RXXR, хоча різні внутрішні амінокислоти можуть змінити ефективність. Для послідовності S2 'MERS і HKU5 також зберігають мотив RXXR; проте в угандинському шипі не вистачає першого аргініну (SNAR), що потенційно впливає на розщеплення.
Пам'ятаючи про змагальному дусі між групами Баріка і Ши Чженлі, цікаво, наскільки ймовірним є, що в Ухані в кінці 2019 року хтось щось теж займався подібними дослідженнями?
Gain-of-Function: «Заборонити не можна продовжити»
Багато, хто вперше чує про вищеописаних дослідженнях, задаються резонним питанням: «А нафіга?» Навіщо вчені створюють химерні віруси-вбивці? Політкоректний відповідь: для розробки превентивної захисту (вакцин та препаратів) від можливих природних химер і для розуміння ризиків їх виникнення. Ось, власне, що самі Барік і Ши Чженлі з співавторами писали на цю тему в тій самій статті 2015 року:
На додаток до підготовки проти майбутніх з'являються вірусів, цей підхід повинен бути розглянутий в контексті запропонованої урядом США паузи в дослідженнях посилення функції (GOF). На підставі попередніх моделей (Fig. 4a, b) створення химерних вірусів, таких як SHC014-MA15, не очікувалося, що збільшиться його патогенність. Хоча SHC014-MA15 аттенуированного в порівнянні з його батьківським мишіноадаптірованним SARS-CoV, аналогічні дослідження, ізучавщіе патогенність CoV з шипом Urbani дикого типу в основі MA15, не показали втрати ваги у мишей, показали знижену реплікацію вірусу. Таким чином, по відношенню до шиповидного білку Urbani-MA15 CoV, SHC014-MA15 демонструє посилення патогенезу (рис. 1). На підставі цих результатів наглядові наукові комітети можуть порахувати подібні дослідження зі створенням химерних вірусів, заснованих на циркулюючих штамах, занадто ризикованими, оскільки не можна виключати підвищення патогенності в ссавців. У поєднанні з обмеженнями на адаптовані до мишей штами і розробкою моноклональних антитіл з використанням побічних мутантів, дослідження появи нових коронавірусів і терапевтичної ефективності можуть бути серйозно обмежені в майбутньому. Разом ці дані і обмеження являють собою перехрестя заклопотаності GOF; потенціал для підготовки до майбутніх спалахів і пом'якшення їх наслідків повинен бути зіставлений з ризиком створення більш небезпечних патогенних мікроорганізмів. При розробці політики в майбутньому важливо враховувати цінність даних, отриманих в результаті цих досліджень, і то, чи заслуговують ці типи досліджень химерних вірусів продовження в порівнянні з притаманними їм ризиками. занадто ризикованими, оскільки не можна виключати підвищення патогенності в ссавців. У поєднанні з обмеженнями на адаптовані до мишей штами і розробкою моноклональних антитіл з використанням побічних мутантів, дослідження появи нових коронавірусів і терапевтичної ефективності можуть бути серйозно обмежені в майбутньому. Разом ці дані і обмеження являють собою перехрестя заклопотаності GOF; потенціал для підготовки до майбутніх спалахів і пом'якшення їх наслідків повинен бути зіставлений з ризиком створення більш небезпечних патогенних мікроорганізмів. При розробці політики в майбутньому важливо враховувати цінність даних, отриманих в результаті цих досліджень, і то, чи заслуговують ці типи досліджень химерних вірусів продовження в порівнянні з притаманними їм ризиками. занадто ризикованими, оскільки не можна виключати підвищення патогенності в ссавців. У поєднанні з обмеженнями на адаптовані до мишей штами і розробкою моноклональних антитіл з використанням побічних мутантів, дослідження появи нових коронавірусів і терапевтичної ефективності можуть бути серйозно обмежені в майбутньому. Разом ці дані і обмеження являють собою перехрестя заклопотаності GOF; потенціал для підготовки до майбутніх спалахів і пом'якшення їх наслідків повинен бути зіставлений з ризиком створення більш небезпечних патогенних мікроорганізмів. При розробці політики в майбутньому важливо враховувати цінність даних, отриманих в результаті цих досліджень, і то, чи заслуговують ці типи досліджень химерних вірусів продовження в порівнянні з притаманними їм ризиками. оскільки не можна виключати підвищення патогенності в ссавців. У поєднанні з обмеженнями на адаптовані до мишей штами і розробкою моноклональних антитіл з використанням побічних мутантів, дослідження появи нових коронавірусів і терапевтичної ефективності можуть бути серйозно обмежені в майбутньому. Разом ці дані і обмеження являють собою перехрестя заклопотаності GOF; потенціал для підготовки до майбутніх спалахів і пом'якшення їх наслідків повинен бути зіставлений з ризиком створення більш небезпечних патогенних мікроорганізмів. При розробці політики в майбутньому важливо враховувати цінність даних, отриманих в результаті цих досліджень, і то, чи заслуговують ці типи досліджень химерних вірусів продовження в порівнянні з притаманними їм ризиками. оскільки не можна виключати підвищення патогенності в ссавців. У поєднанні з обмеженнями на адаптовані до мишей штами і розробкою моноклональних антитіл з використанням побічних мутантів, дослідження появи нових коронавірусів і терапевтичної ефективності можуть бути серйозно обмежені в майбутньому. Разом ці дані і обмеження являють собою перехрестя заклопотаності GOF; потенціал для підготовки до майбутніх спалахів і пом'якшення їх наслідків повинен бути зіставлений з ризиком створення більш небезпечних патогенних мікроорганізмів. При розробці політики в майбутньому важливо враховувати цінність даних, отриманих в результаті цих досліджень, і то, чи заслуговують ці типи досліджень химерних вірусів продовження в порівнянні з притаманними їм ризиками. У поєднанні з обмеженнями на адаптовані до мишей штами і розробкою моноклональних антитіл з використанням побічних мутантів, дослідження появи нових коронавірусів і терапевтичної ефективності можуть бути серйозно обмежені в майбутньому. Разом ці дані і обмеження являють собою перехрестя заклопотаності GOF; потенціал для підготовки до майбутніх спалахів і пом'якшення їх наслідків повинен бути зіставлений з ризиком створення більш небезпечних патогенних мікроорганізмів. При розробці політики в майбутньому важливо враховувати цінність даних, отриманих в результаті цих досліджень, і то, чи заслуговують ці типи досліджень химерних вірусів продовження в порівнянні з притаманними їм ризиками. У поєднанні з обмеженнями на адаптовані до мишей штами і розробкою моноклональних антитіл з використанням побічних мутантів, дослідження появи нових коронавірусів і терапевтичної ефективності можуть бути серйозно обмежені в майбутньому. Разом ці дані і обмеження являють собою перехрестя заклопотаності GOF; потенціал для підготовки до майбутніх спалахів і пом'якшення їх наслідків повинен бути зіставлений з ризиком створення більш небезпечних патогенних мікроорганізмів. При розробці політики в майбутньому важливо враховувати цінність даних, отриманих в результаті цих досліджень, і то, чи заслуговують ці типи досліджень химерних вірусів продовження в порівнянні з притаманними їм ризиками. дослідження появи нових коронавірусів і терапевтичної ефективності можуть бути серйозно обмежені в майбутньому. Разом ці дані і обмеження являють собою перехрестя заклопотаності GOF; потенціал для підготовки до майбутніх спалахів і пом'якшення їх наслідків повинен бути зіставлений з ризиком створення більш небезпечних патогенних мікроорганізмів. При розробці політики в майбутньому важливо враховувати цінність даних, отриманих в результаті цих досліджень, і то, чи заслуговують ці типи досліджень химерних вірусів продовження в порівнянні з притаманними їм ризиками. дослідження появи нових коронавірусів і терапевтичної ефективності можуть бути серйозно обмежені в майбутньому. Разом ці дані і обмеження являють собою перехрестя заклопотаності GOF; потенціал для підготовки до майбутніх спалахів і пом'якшення їх наслідків повинен бути зіставлений з ризиком створення більш небезпечних патогенних мікроорганізмів. При розробці політики в майбутньому важливо враховувати цінність даних, отриманих в результаті цих досліджень, і то, чи заслуговують ці типи досліджень химерних вірусів продовження в порівнянні з притаманними їм ризиками.
Початковий текст
Окрім того, щоб запропонувати підготовку до майбутніх вірусів, цей підхід слід розглядати в контексті паузи, яку зобов’язав уряд США щодо досліджень щодо збільшення функцій (GOF). На основі попередніх моделей появи (рис. 4а, б) створення химерних вірусів, таких як SHC014-MA15, не очікувало посилення патогенності. Незважаючи на те, що SHC014-MA15 ослаблений відносно свого адаптованого до батьківської миші SARS-CoV, аналогічні дослідження, що вивчали патогенність CoVs з диким типом Urbani у шипі MA15, не показали втрати ваги у мишей та зменшили вірусну реплікацію. Таким чином, відносно шипу Урбані – MA15 CoV, SHC014-MA15 показує посилення в патогенезі (рис. 1). На основі цих висновків групи наукових оглядів можуть вважати подібні дослідження побудови химерних вірусів на основі циркулюючих штамів, занадто ризикованих для здійснення, оскільки підвищена патогенність у моделях ссавців не може бути виключена. У поєднанні з обмеженнями на адаптованих мишами штамів та виробленням моноклональних антитіл із застосуванням мутантів-евакуаторів, дослідження виникнення CoV та терапевтичної ефективності можуть бути сильно обмежені, рухаючись вперед. Разом ці дані та обмеження є перехрестям проблем, пов'язаних з дослідженнями Міністерства фінансів; Потенціал для підготовки та пом'якшення майбутніх спалахів повинен бути зважений до ризику створення більш небезпечних збудників. При розробці політики, яка рухається вперед, важливо враховувати цінність даних, отриманих в результаті цих досліджень, і чи ці типи химерних вірусних досліджень вимагають подальшого дослідження порівняно з пов'язаними з цим ризиками. У поєднанні з обмеженнями на адаптованих мишами штамів та виробленням моноклональних антитіл із застосуванням мутантів-евакуаторів, дослідження виникнення CoV та терапевтичної ефективності можуть бути сильно обмежені, рухаючись вперед. Разом ці дані та обмеження є перехрестям проблем, пов'язаних з дослідженнями Міністерства фінансів; Потенціал для підготовки та пом'якшення майбутніх спалахів повинен бути зважений до ризику створення більш небезпечних збудників. При розробці політики, яка рухається вперед, важливо враховувати цінність даних, отриманих в результаті цих досліджень, і чи ці типи химерних вірусних досліджень вимагають подальшого дослідження порівняно з пов'язаними з цим ризиками. У поєднанні з обмеженнями на адаптованих мишами штамів та виробленням моноклональних антитіл із застосуванням мутантів-евакуаторів, дослідження виникнення CoV та терапевтичної ефективності можуть бути сильно обмежені, рухаючись вперед. Разом ці дані та обмеження є перехрестям проблем, пов'язаних з дослідженнями Міністерства фінансів; Потенціал для підготовки та пом'якшення майбутніх спалахів повинен бути зважений до ризику створення більш небезпечних збудників. При розробці політики, яка рухається вперед, важливо враховувати цінність даних, отриманих в результаті цих досліджень, і чи ці типи химерних вірусних досліджень вимагають подальшого дослідження порівняно з пов'язаними з цим ризиками. ці дані та обмеження є перехрестям проблем, пов'язаних з дослідженнями Міністерства фінансів; Потенціал для підготовки та пом'якшення майбутніх спалахів повинен бути зважений до ризику створення більш небезпечних збудників. При розробці політики, яка рухається вперед, важливо враховувати цінність даних, отриманих в результаті цих досліджень, і чи ці типи химерних вірусних досліджень вимагають подальшого дослідження порівняно з пов'язаними з цим ризиками. ці дані та обмеження є перехрестям проблем, пов'язаних з дослідженнями Міністерства фінансів; Потенціал для підготовки та пом'якшення майбутніх спалахів повинен бути зважений до ризику створення більш небезпечних збудників. При розробці політики, яка рухається вперед, важливо враховувати цінність даних, отриманих в результаті цих досліджень, і чи ці типи химерних вірусних досліджень вимагають подальшого дослідження порівняно з пов'язаними з цим ризиками.
Чи були ці слова пророчими? В кінці 2014-го року США ввели мораторій на державне фінансування таких gain-of-function досліджень, але майже відразу (в 2017-му) скасували . А в Китаї ніякого мораторію на такі дослідження не вводили, а навіть навпаки відкривали нові «супер (без) небезпечні лабораторії» рівня BSL-4, як в 2017 році в Ухані :
Про всяк випадок, поясню, що до 2017 року лабораторія в Уханьского інституті вірусології була класу BSL-3, якого було достатньо для роботи з коронавірусами. Наведу декілька цитат з вищенаведеної замітки про створення Уханьского BSL-4 лабораторії:
У планах на майбутнє - вивчення патогена, що викликає атипову пневмонію, для якого також не потрібно лабораторія BSL-4, перш ніж перейти до вивчення вірусу Ебола і західноафриканської вірусу Ласса. Близько мільйона китайців працюють в Африці; країна повинна бути готова до будь-якої ситуації, говорить Юань. «Віруси не знають кордонів». ... План по розширенню мережі підсилює такі побоювання. Одна лабораторія BSL-4 в Харбіні вже чекає акредитації; наступні дві, як очікують, будуть в Пекіні і Куньміні, остання зосередився на використанні мавп для вивчення хвороб.
Ліна каже, що розмір Китаю виправдовує такого розмаху, і що можливість об'єднати дослідження BSL-4 з великою кількістю дослідницьких мавп - китайські дослідники стикаються з набагато меншою кількістю бюрократичних зволікань, ніж на Заході, коли справа доходить до досліджень на приматах - може бути потужною. «Якщо ви хочете протестувати вакцини або противірусні препарати, вам потрібна модель приматів, відмінних від людини», - каже Ліна.
Але Ебрайт не впевнений в необхідності більш однієї лабораторії BSL-4 в материковому Китаї. Він підозрює, що розширення там є реакцією на мережі лабораторій в Сполучених Штатах і Європі, що, за його словами, також невиправдано. Він додає, що уряду будуть припускати, що така надмірна потужність призначена для потенційного розвитку біологічної зброї.
«Ці об'єкти по своїй суті призначені для подвійного використання», - говорить він. Перспектива розширення можливостей для введення мавпам патогенних мікроорганізмів також турбує, а не надихає його: «Вони можуть бігати, вони можуть дряпати, вони можуть кусати».
Тревано каже, що інвестиції Китаю в лабораторію BSL-4 можуть, перш за все, стати способом довести світові, що країна конкурентоспроможна. «Це великий статусний символ в біології, - говорить він, - незалежно від того, потрібні вони чи ні».
Початковий текст
Плани на майбутнє включають вивчення збудника, який викликає ГРВІ, який також не потребує лабораторії BSL-4, перш ніж перейти до Еболи та вірусу західноафриканської Ласси. В Африці працює близько мільйона китайців; Юань повинен бути готовий до будь-яких подій, говорить Юань. "Віруси не знають кордонів". … План розширення в мережі посилює такі проблеми. Одна лабораторія BSL-4 у Харбіні вже чекає акредитації; наступні два очікуються у Пекіні та Кунміні, останній зосередився на використанні моделей мавп для вивчення хвороб. Ліна каже, що розмір Китаю виправдовує цей масштаб, і що можливість поєднати дослідження BSL-4 з великою кількістю мавп-дослідників - китайські дослідники стикаються з меншою тяганиною, ніж ті, хто на Заході, коли йдеться про дослідження приматів - може бути вагомим. "Якщо ви хочете протестувати вакцини або противірусні препарати, вам потрібна модель приматів, що не мають людини", - каже Ліна. Але Ебрійт не переконаний у необхідності створення декількох лабораторій BSL-4 у материковому Китаї. Він підозрює, що розширення є реакцією на мережі в США та Європі, які, за його словами, також є необґрунтованими. Він додає, що уряди будуть вважати, що така надмірна спроможність є для потенційного розвитку біозброї. "Ці засоби по своїй суті є подвійним використанням", - говорить він. Перспектива нарощування можливостей ввести мавп із збудниками хвороби також хвилює, а не хвилює: «Вони можуть бігати, вони можуть подряпатися, вони можуть кусати». Треван каже, що інвестиції Китаю в лабораторію BSL-4 можуть, перш за все, стати способом довести світові, що нація є конкурентоспроможною. «Це великий статус статусу в біології, - каже він, - чи це потреба, чи ні».
Цікаво, що крім Ухань, нову BSL-4 лабораторію планували відкрити в Куньміні, причому з прицілом на тестування вакцин на приматах. Куньмін, нагадаю, це столиця Юньнані. Саме в довколишніх печерах Ши Чженлі виявила ті самі штами Rs3367 і RsSHC014. До речі, тестування на приматах згадувалося в якості можливих подальших кроків для розробки превентивних вакцин проти потенційних майбутніх спалахів коронавируса в «тій самій» (скільки разів я її вже так назвав?) Статті Баріка і Ши Чженлі:
Проте, потрібне подальше тестування на нелюдських приматах, щоб перевести ці знахідки в патогенний потенціал у людей. Важливо відзначити, що недолік доступних терапевтичних засобів визначає критичну необхідність подальшого вивчення і розробки методів лікування. Володіючи цими знаннями, можна розробити програми епіднагляду, діагностичні реагенти та ефективні методи лікування, які можуть захистити від появи коронавірусів, специфічних для групи 2b, таких як SHC014, і можуть застосовуватися до інших Коронавірусние гілкам, які підтримують аналогічні гетерогенні пули.
Початковий текст
Однак необхідні подальші тестування на нелюдських приматів, щоб перетворити ці знахідки на патогенний потенціал у людини. Важливо, що невдача доступних терапевтичних препаратів визначає критичну потребу в подальшому дослідженні та розробці методів лікування. На основі цих знань можуть бути вироблені програми спостереження, діагностичні реагенти та ефективні методи лікування, які захищають від виникнення специфічних CoVs групи 2b, таких як SHC014, і вони можуть бути застосовані до інших гілок CoV, які підтримують аналогічний гетерогенний пул.
Цілком можливо, що до 2019 року створення та тестування потенційних вакцин від різних SARS-like коронавирусов вже йшло повним ходом.
Про скільки епідемій дивних готує просвіти дух ...
Ну що ж, давайте вже розглянемо версію про лабораторної витоку. Для початку наведу коротку історичну довідку про інших витоках. Тому що пагони вірусів з лабораторій в минулому траплялися неодноразово. В першу чергу, того ж SARS-CoV: вперше він втік влітку 2003 року в Сінгапурі, потім в грудні 2003 на Тайвані, а навесні 2004 в двічі втікав в Пекіні.
Були тривожні дзвіночки і в Європі і США, хоча там обійшлося без заражень. Наприклад, у Франції лабораторія якось втратила пробірки з SARS-му , а в США BSL-4 лабораторія в Техасі недорахувалися пробірки з вірусом венесуельської геморагічної лихоманки:
Тільки один вчений працював з вірусом, і Рейес сказав, що лабораторія підозрює, що вчений випадково викинув пробірку в листопаді. ... В Галвестонський биолаборатории найсуворіші заходи безпеки, тому що вона вивчає матеріали рівня біологічної безпеки BSL-4, тобто небезпечні інфекційні захворювання, які не мають вакцин або ліків. Матеріали BSL-4 включають Guanarito, Ебола і віспу.
Початковий текст
Лише один вчений працював з вірусом, і Рейєс заявив, що лабораторія підозрює, що вчений випадково викинув флакон у листопаді. … Біолабораторія Галвестона потребує найжорсткіших заходів безпеки, оскільки вона вивчає матеріали BSL-4 на рівні біозабезпечення або небезпечні інфекційні захворювання, які не мають вакцини чи ліки. Матеріали BSL-4 включають гуанаріто, еболу та віспу.
Історія знає і інші, куди більш широкомасштабні витоку . Наприклад, «воскресіння» вірусу грипу H1N1 в 1977 році, який до цього вважався зниклим. Так, це вірус тієї самої «іспанки»:
Віруси людського грипу H1N1 з'явилися з пандемією 1918 року і зберігалися, накопичуючи невеликі зміни в геномі (з серйозними змінами в 1947 році), поки в 1957 року не з'явився «азіатський» грип H2N2, що викликав всесвітню пандемію. Вірус грипу H1N1, мабуть, вимер, і не виділявся протягом 20 років. У 1969 році вірус H3N2 в Гонконзі замінив вірус H2N2 і продовжує циркулювати.
У вересні 1977 р вірус грипу H1N1 був виділений з хворих в далекосхідному регіоні Радянського Союзу, а в початку 1978 р китайці повідомили, що в травні 1977 року вони виділили вірус H1N1 на північному сході Китаю, в регіоні, прилеглому до місця радянської спалаху. Використовуючи ранні генетичні інструменти, доступні в той час, було виявлено, що вірус H1N1 1977 року тісно пов'язаний з вірусами людського грипу H1N1, що циркулювали в 1949-1950 роках, але не з тими, які циркулювали раніше або пізніше. ... Тільки починаючи з 2009-2010 рр. в наукових роботах стало прямо вказуватися, що поява грипу H1N1 в 1977 році було лабораторної витоком: «Найбільш відомий випадок витоку лабораторного штаму - це знову виник вірус грипу A H1N1, який вперше був виявлений в Китаї в травні 1977 року і незабаром після цього в Росії ». ... Припущення про те, що витік 1977 р могла бути пов'язана з дослідженнями вакцин проти H1N1, підтверджується спостереженням, що в початкових спалахи в Китаї дев'ять з десяти вірусних ізолятів висловлювали «температурну чутливість» (Kung 1978). Чутливість до температури, як правило, незвичайна риса, але в 1970-х роках вона була (і все ще залишається) фундаментальною рисою для створення ослаблених живих вакцин проти грипу. Чутливість до температури зазвичай виникає тільки після серії істотних лабораторних маніпуляцій і відборів.
Цікаво, що подальші дослідження показали, що циркулюють штами в 1977-78 рр. часто складалися з змішаних температурно-чутливих і нормальних компонентів, і що чутливість до температури, мабуть, швидко зникла з штаму H1N1 Демократичної Республіки після 1978 р Витік штаму H1N1, що проходить лабораторне ослаблення шляхом створення чутливих до температури мутантів, могла забезпечити саме таку змішану популяцію. У 1976-77 роках лабораторний персонал молодше 20 років не був знайомий зі штамами грипу H1N1 до 1957, тому міг бути підданий інфікування в лабораторії. Низька тяжкість пандемії 1977 року може бути частково обумовлена чутливістю вірусу до температури, що обмежує реплікацію вірусу в легеневих тканинах.
Початковий текст
Віруси грипу H1N1 людини з'явилися з пандемією 1918 р. Та зберігалися, сповільнюючи накопичення невеликих змін у своєму геномі (з серйозними змінами у 1947 р.), Поки в 1957 р. Не з’явився «азіатський» грип H2N2, що спричинило світову пандемію. Потім вірус грипу H1N1, очевидно, вимер, і не був виділений протягом 20 років. У 1969 р. Вірус «Гонконгу» H3N2 замінив вірус H2N2 і досі розповсюджується. У вересні 1977 року вірус грипу H1N1 був виділений від інфекцій людини в Далекосхідному регіоні Радянського Союзу, а на початку 1978 року китайці повідомили, що в травні 1977 року на північному сході Китаю, поруч із спалахом радянської війни, виділили вірус H1N1. За допомогою ранніх генетичних інструментів, наявних у той час, було виявлено, що вірус H1N1 1977 року тісно пов'язаний з вірусами грипу людини H1N1, що циркулювали в 1949–1950 роках, але не з тими, що циркулювали раніше чи пізніше. … Лише з 2009–2010 рр. Основні статті безпосередньо почали стверджувати, що поява грипу H1N1 1977 р. Було лабораторним випуском: „Найвідомішим випадком вивільненого лабораторного штаму є повторно виниклий вірус грипу H1N1, який вперше спостерігався в Китаї у травні 1977 року, і незабаром після цього в Росії ». … Міркування про те, що випуск 1977 року, можливо, було пов'язано з дослідженнями вакцини проти H1N1, підтверджується спостереженням, що в початкових спалахах Китаю дев'ять з десяти вірусних ізолятів виражали «температурну чутливість» (Kung 1978). Температурна чутливість зазвичай є нечастою ознакою, але така, яка була в 1970-х роках (і досі є), є основною ознакою виготовлення живих ослаблених вакцин проти грипу. Температурна чутливість, як правило, виникає лише після ряду суттєвих лабораторних маніпуляцій та виділень. Цікаво, що подальше дослідження показало, що циркулюючі штами в 1977–78 рр. Часто складалися із змішаних температурно-чутливих та нормальних компонентів, і ця температурна чутливість, очевидно, швидко зникла з лінії H1N1 після 1978 року. Втеча серед середнього протоколу популяції вірусу H1N1, що проходить лабораторний відбір мутантів, чутливих до температури, забезпечить таку змішану популяцію. У 1976–77 рр. Співробітники лабораторії в кінці підлітків або на початку 20-х років не були б схильні до вірусу грипу H1N1 до 1957 р. Та були б чутливі до лабораторних інфекцій. Низька вираженість пандемії 1977 року може бути частково обумовлена температурною чутливістю вірусу - ознакою, яка обмежує реплікацію вірусу в легеневих тканинах.
Схоже, створення температурно-чутливих вірусних мутантів для розробки потенційних «ослаблених» вакцин було широко поширене в кінці ХХ століття. Якщо пам'ятаєте, в 1990-м Барік теж експериментував зі створенням температурно-чутливих штамів.
Чи могло щось подібне стати причиною коронавирусной пандемії 2019 го? Чому ні? Тут можливі кілька варіантів - від розробки потенційної вакцини до просто дослідних робіт з лабораторної рекомбінації летучемишіного і панголіни вірусів. Який-небудь особливо амбітний дослідник міг навіть просто за особистою ініціативою вирішити об'єднати дві «модні теми» - додавання фурінового сайту і пересадку RBM з штаму одного виду (панголіни) в інший (кажани), щоб потім, підтвердивши підвищену вірулентність нової химерної конструкції, випустити чергову грізну статтю про те, яка небезпека чекає людство в Юньнаньськоє печерах або на мокрих ринках. А якщо ще й вакцину проти такого небезпечного штаму вдалося б превентивно створити, то шану і повагу такому досліднику були б гарантовані.
Стверджую я, що так все і було? Звичайно ж ні. Тому що на сьогоднішній день докази такого сценарію відсутні. Є тільки низка дивних збігів - наприклад, що спалах юньнаньского коронавируса сталася за тисячі кілометрів від Юньнані саме на тому ринку, який найближче до Уханьского інституту вірусології. А може, і не на ринку, так як з перших 4-х хворих пацієнтів, троє на ринку не бували . Ну і збіги за структурними особливостями генома вірусу, які нагадують ті маніпуляції, які вірусологи не раз проводили з такими вірусами в лабораторії. Але збіги - це ще не доказ.
Більш того, збіги трапляються, і, звичайно ж, в природі такої штам теж цілком міг виникнути. Ще не дуже ясно як саме - для цього летучемишіний і панголіни штами повинні були зустрітися в одній клітці (клітці чийогось організму, а не металевою), причому в Ухані, так як спалах стався саме там (інакше ми б бачили інші осередки Ковіда по шляху проходження першого зооносітеля в Ухань). З урахуванням того, що кажани на Уханьского ринку не продавалися , і взагалі в цей час року в сплячці, такий варіант все ще залишається нерозгаданою таємницею.
До речі, зовсім недавно з'явилася новина, що в 2018-му році американські фахівці проводили інспекцію Уханьского інституту вірусологи, і навіть спілкувалися з Ши Чженлі. Результатом їх «екскурсії» стали дві дипломатичних телеграми до Вашингтона, в яких вони відзначили ряд слабких місць в забезпеченні безпеки лабораторії:
Джерела, знайомі з телеграмами, сказали, що вони повинні були підняти тривогу з приводу серйозних проблем безпеки в лабораторії WIV, особливо щодо її роботи з коронавірусами кажанів. Співробітники посольства закликали до того, щоб США приділяли більше уваги цій лабораторії і надавали їй додаткову підтримку. ... «Під час взаємодії з вченими з лабораторії WIV вони відзначили, що в новій лабораторії існує серйозна нестача належним чином підготовлених технічних фахівців і дослідників, необхідних для безпечної експлуатації цієї лабораторії з високим рівнем захисту», - йдеться в телеграмі від 19 січня 2018 року, яку підготували два співробітника відділу охорони навколишнього середовища, науки і охорони здоров'я посольства, особисто зустрічалися з ученими з WIV. (Державний департамент відмовився коментувати цю та інші деталі історії.) Китайські дослідники в WIV отримували допомогу від Галвестонський Національної лабораторії в Медичному відділенні Університету Техасу та інших організацій в США, але китайці звернулися за додатковою допомогою. У телеграмах стверджується, що Сполучені Штати повинні надати подальшу підтримку лабораторії в Ухані, головним чином тому, що їх дослідження коронавирусов кажанів було важливим, але також і небезпечним.
Початковий текст
Джерела, знайомі з кабелями, казали, що вони повинні були викликати тривогу з приводу серйозних проблем безпеки в лабораторії WIV, особливо щодо її роботи з коронавірусами кажана. Чиновники посольства закликали більше уваги США до цієї лабораторії та більше підтримати її, щоб допомогти їй вирішити свої проблеми. … «Під час взаємодії з науковцями лабораторії WIV вони зазначили, що в новій лабораторії є серйозний дефіцит належним чином підготовлених техніків та слідчих, необхідних для безпечної експлуатації цієї високоміцної лабораторії», - йдеться у телеканалі 19 січня 2018 року, який було розроблено двома чиновниками з питань навколишнього середовища, науки та охорони здоров'я посольства, які зустрілися з науковцями WIV. (Державний департамент відмовився коментувати цю та інші деталі історії.) Китайські дослідники WIV отримували допомогу з Національної лабораторії Галвестона в Техаському університеті Техаського університету та інших американських організацій, але китайці вимагали додаткової допомоги. Кабелі стверджували, що США повинні надавати лабораторії Вухана подальшу підтримку, головним чином тому, що його дослідження коронавірусів кажанів були важливими, але й небезпечними.
Забавно, що уханьцам допомагала та сама техаська лабораторія в Галвестоні, яка свого часу сама втратила пробірку з венесуельським вірусом. Причому допомагала вона не тільки на словах, там дійсно проходили навчання Уханьского фахівці, про що навіть писав «Уханьський вісник» (правда, зараз публікацію з сайту видалили, але на вебархіве вона поки доступна ):
Останній штрих до сімейного портрета лабораторних витоків: у листопаді 2019 го в Ланьчжоу відразу в двох дослідницьких центрах стався спалах бруцельозу (бактеріальної інфекції), що вразила понад 100 працювали там дослідників.
Можливі сліди рукотворності
Потім того залишимо вірусологів в спокої і звернемо наш погляд знову на сам вірус. Чи є в ньому якісь явні ознаки рукотворності? Для початку пару слів про те, що значить «явні». Зрозуміло, що в природі можуть статися будь-які мутації абсолютно випадково. Навіть якби врізка, яка створила фуріновий сайт в CoV2 була не «PRRA", а "MADEINWVHANPRRA", то все одно залишався б ненульовий шанс, що вона могла виникнути випадково. Але для нас, так і для будь-якого суду, думаю, цього було б достатньо, щоб довести рукотворне походження beyond a reasonable doubt .
Головна проблема з такими доказами полягає в тому, що навіть в рукотворному вірус їх просто може не бути. Грубо кажучи, хороший генний інженер може створити синтетичний вірус «ідентичний натуральному». Більш того, часто дослідники навмисно привносять в свої конструкції якісь синонімічні мутації для того, щоб потім можна було розрізнити їх штам і природний. Але якщо творець вірусу ці маркери рукотворності сам не розкриває, відрізнити їх від природних мутацій неможливо.
Але іноді сліди можуть і залишатися, особливо якщо творці не намагаються приховати рукотворность своєї конструкції. В першу чергу, мова про місця розрізів ДНК (нагадаю, що маніпуляції з РНК-вірусами проводяться саме в комплементарних їм ДНК-конструкціях ), необхідних творцям для зшивання різних сегментів геному або для вирізання старих і вставки нових ділянок. Адже ДНК можна розрізати не в довільних місцях (Кріспер не береться до уваги), а тільки там, де послідовність нуклеотидів (зазвичай 4-6 «букв») збігається з тією послідовністю, яку розпізнає та чи інша рестриктаза, Тобто фермент, який розщеплює ланцюжка нуклеотидів. При цьому такий аналіз ускладнює те, що існують сотні різних типів рестриктаз, які використовуються в генній інженерії. Але давайте спробуємо провести такий аналіз для CoV2.
Для початку - приклад роботи групи Баріка від 2008 року, де вони взяли Bat-SCoV і замінили RBD в його шиповидном білку на RBD з людського SARS-а. Ось як вони описують створення своєї химери:
Схематичне представлення варіантів SARS-CoV і Bat-SCoV.(A) Схематичне представлення геномів SARS-CoV і Bat-SCoV (інвентарний номер GenBank FJ211859) і системи зворотного генетики. (Вгорі) стрілки вказують сайти процесингу вірусної протеази nsp всередині поліпротеїну ORF1ab (відкриті стрілки, папаїн-подібна протеаза; зафарбовані стрілки, nsp5 [3C-подібна протеаза]). Відразу нижче наведені фрагменти, використані в системі зворотної генетики, позначені від A до F. Фрагменти, синтезовані для створення Bat-SCoV, точно відтворюють з'єднання фрагментів SARS-CoV, за винятком того, що Bat-SCoV має 2 фрагмента, Bat-E1 і Bat-E2, які відповідають фрагменту SARS-E.
Початковий текст
Схематичне зображення варіантів SARS-CoV та Bat-SCoV. (A) Схематичне зображення геномів SARS-CoV та Bat-SCoV (приєднання GenBank № FJ211859 ) та системи зворотної генетики. (Вгорі) Стрілками вказують сайти nsp-обробки в поліпротеїні ORF1ab (відкриті наконечники стріл, опосередкована папаїном протеїназа; заповнені наконечники стріл, опосередкована nsp5 [3С-подібна протеїназа]). Безпосередньо нижче розміщені фрагменти, використовувані в системі зворотної генетики, позначені від A до F. Фрагменти, синтезовані для генерації Bat-SCoV, точно рекапітулюють фрагментні з'єднання SARS-CoV, за винятком того, що Bat-SCoV має 2 фрагменти, Bat-E1 і Bat-E2, які відповідають фрагменту SARS-E.
Як бачимо, спочатку група Баріка створила синтетичний клон летучемишіного Bat-SCoV, причому «за лекалами» вже створеного ними раніше синтетичного клону SARS-CoV. Тобто для летучемишіного клону вони використовували ті ж 6 сегментів з тими ж сайтами рестриктаз, які раніше вони використовували для SARS-CoV, що дозволило їм міняти місцями сегменти вірусу між різними штамами як шматки Лего. Ось докладний опис створення химерного мутанта:
Віруси, що містять ПЛР-генеровані вставки в вірусний геном, були отримані з використанням стратегії збірки SARS-CoV (24, 33, 53) з наступними модифікаціями. Якщо коротко, для вірусу Bat-F кДНК повної довжини конструювали шляхом лігування продуктів рестрикції з фрагментів AE SARS-CoV і фрагмента F Bat-SCoV, що вимагало розщеплення Bgl-NotI. Для Bat-SCoV і Bat-SRBD, Bat-SRBM і Bat-Hinge плазміди, що містять 7 фрагментів кДНК генома Bat-SCoV, були розщеплені з використанням BglI для Bat-A, Bat-B, Bat-C і Bat -D, BglI і AflII для Bat-E1 і Bat-E2 і BglI і NotI для Bat-F. Розщеплені, очищені фрагменти одночасно лігували разом. Транскрипція здійснювалася з використанням набору m7Message mMachine (Ambion), потім РНК електропоріровалі в клітини Vero (24, 53).
Початковий текст
Віруси, що містять вбудовані ПЛР вставки у послідовності кодування вірусів, вироблялися за допомогою стратегії складання SARS-CoV (24, 33, 53) з наступними модифікаціями. Коротко кажучи, для вірусу Bat-F повна довжина кДНК була сконструйована шляхом лігування продуктів рестрикції з фрагментів SARS-CoV A – E та фрагмента Bat-SCoV F, які потребували перетравлення BglI-NotI. Для Bat-SCoV і Bat-SRBD, Bat-SRBM і Bat-Hinge плазміди, що містять 7 фрагментів кДНК генома Bat-SCoV, були перетравлені за допомогою BglI для Bat-A, Bat-B, Bat-C і Bat -D, BglI і AflII для Bat-E1 і Bat-E2, а BglI і NotI для Bat-F. Перетравлені, очищені гелем фрагменти одночасно зв'язували разом. Транскрипцію здійснювали за допомогою набору mMachine T7 mMessage (Ambion), і РНК електропорували в клітини Vero (24, 53).
Всі ці трьохбуквені абревіатури (BglI, AflII, NotI і т.д.) в виділеному вище пропозиції і є різними типами рестриктаз. Давайте подивимося, чи будуть помітні якісь відмінності в сайтах рестриктаз в геномі (шиповидного білка) химери в порівнянні з геномом вихідного SARS-CoV:
Як видно, сайти рестриктаз у химери практично ідентичні тим шматках вихідних послідовностей в Bat-SCoV або SARS, звідки вони були взяті. Єдині відмінності помітні в місцях зшивання вставленого шматка з SARS. Ось, наприклад лівий (5'-) край вставки:
Тут у Bat-SCoV і SARS виявилася загальна ідентична область нуклеотидів (перетин бірюзовою і рожевої областей), і в місці зшивання двох послідовностей ніяких нових сайтів рестриктаз немає, а навпаки пропав сайт SspI з SARS-а. А ось правий (3') край вставки:
Тут в місці склеювання навпаки залишилися всі старі рестріктазного сайти, і навіть з'явилися нові, наприклад, EcoR II. Якби я не знав, що химерний геном є наслідком рукотворних маніпуляцій, зміг би я це зрозуміти, дивлячись на ці 3 сиквенсу? Навряд чи, навіть якби у мене і закралися якісь підозри, то точно не beyond a reasonable doubt . Бути може, фахівцям в генній інженерії це було б видно з якихось іншими ознаками, стверджувати не беруся - тут буду радий будь-якому лікнепу.
Але в будь-якому випадку, давайте порівняємо шіповідний білок у RaTG13, CoV2 і панголіни-19. Раптом там що-небудь на нас як вискочить, як вистрибне!
Ось так виглядає RBD (виділено салатовим) і RBM (жовтим) у всіх трьох:
Що тут цікавого? Цікаво було бачити сайт EcoR I на 5'-краї RBM у всіх трьох (перший стик між салатовой і жовтою областями) - вельми зручно. Цікаво, наскільки це поширена фіча у інших штамів? Побіжний аналіз показав, що наша трійця - рекордсмени за кількістю таких сайтів в геномі, у інших летучемишіних штамів їх всього по 5:
Повертаючись до аналізу RBD, з особливостей CoV2 можна відзначити нові сайти рестриктаз, виділені червоними прямокутниками - вони збігаються з унікальними мутаціями в амінокислотноїпослідовності (теж відзначені червоними прямокутниками на амінокислотних сиквенс в крайній правій колонці). Про всяк випадок я виділив ще кілька нових сайтів: блакитні прямокутники і зелений прямокутник, який знаходиться в районі єдиною амінокислоти зі змінною між RBM CoV2 і панголіни-19.
Давайте ще порівняємо у всіх трьох штамів місце врізки PRRA, що створила в CoV2 фуріновий сайт:
Тут теж з'явилося кілька нових сайтів (виділені блакитним) по обидві сторони від нової вставки. Чи могли вони бути використані для створення фурінового сайту? Теоретично так. Але вставку можна було зробити і використовуючи наявні сайти, або навіть створивши сегменти з новими сайтами, які потім з'єднати «бесшовно», тобто не створюючи нових сайтів на стику. Якщо пам'ятаєте, Барік ще в 2002 році застосував цю технологію для створення синтетичного клону мишачого коронавируса:
Місця з'єднання сайтів рестрикції, які розташовані на кінцях кожної кДНК, систематично видаляються в процесі побудови повного повнорозмірного продукту кДНК, що дозволяє проводити повторну збірку без внесення змін нуклеотидів.
Початковий текст
З’єднувальні між собою з'єднання рестрикційних ділянок, розташовані на кінцях кожної кДНК, систематично видаляються під час складання повного продукту кДНК повної довжини, дозволяючи повторно складати без внесення нуклеотидних змін.
Щоб швидко зібрати консенсусні клони, ми використовували рестрикційні ендонуклеази класу IIS, які розрізають в асиметричних ділянках і залишають асиметричні кінці. Ці ферменти генерують специфічні унікальні оверхенгі, які забезпечують безшовне лігування двох кДНК з подальшою втратою рестріктазного сайту .
Початковий текст
Для швидкого збирання консенсусних клонів ми використовували рестрикційні ендонуклеази класу IIS, які ріжуться на асиметричних ділянках і залишають асиметричні кінці. Ці ферменти генерують унікальні для ниток специфічні нитки, що дозволяють безперешкодно перев’язувати дві кДНК із супутньою втратою сайту рестрикції.
Сьогодні технологія жонглювання генними послідовностями вже настільки автоматизована і поставлена на потік, що в китайській статті від жовтня 2019 роки про врізку нового фурінового сайту в курячий коронавірус її опису відведено лише пару пропозицій:
2.2. Створення рекомбінантного вірусу Рекомбінантний вірус rYN-S2 / RRKR, що містить шіповідний білок з фуріновим сайтом S2 ', був отриманий шляхом vaccinia рекомбінації, як описано раніше [20, 28]. Якщо коротко, плазмиду з фуріновим сайтом S 'генерували з використанням набору для безшовної збірки Seamless Assembly kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) і трансфіковані в клітини CV-1, інфіковані вірусом vaccinia, що містить геном YN-? S-GPT. Сайт Furin-S2 був введений в кДНК YN шляхом гомологічної рекомбінації з використанням системи тимчасової домінантною селекції [25].
Початковий текст
2.2. Генерація рекомбінантного вірусу Рекомбінантний вірус rYN-S2 / RRKR, що містить S білок з фурином-S2? сайт генерувався рекомбінацією вакцинії, як описано раніше [20,28]. Коротко кажучи, плазміда з фурином-S2? сайт генерували за допомогою набору безшовної збірки (Invitrogen, Карлсбад, Каліфорнія, США) та трансфікували в клітини CV-1, заражені вірусом вакцинії, що містять геном YN-? S-GPT. Сайт Furin-S2 'був введений в кДНК YN гомологічною рекомбінацією за допомогою перехідної домінантної системи відбору [25].
Неможливо не захоплюватися тим, до чого дійшов прогрес! Ось опис вищезгаданого набору для безшовної збірки Seamless Assembly kit :
Набір для безшовного клонування і збірки GeneArt дозволяє одночасно і направлено клонувати від 1 до 4 фрагментів ПЛР, що складаються з будь-якій послідовності, в будь-лінеаризоване вектор за допомогою однієї 30-хвилинної реакції при кімнатній температурі . Набір містить все необхідне для збірки фрагментів ДНК і їх трансформації в E.coli для відбору і зростання рекомбінантних векторів. • Швидкість і простота - клонуйте до 4 фрагментів ДНК з обраної послідовністю одночасно в одному векторі (до 13 Кб); не потрібні сайти рестрикції, лігування або рекомбінації • Точність і ефективність - призначений для клонування того, що ви хочете, де ви хочете, в потрібній орієнтації і досягнення до 90% правильних клонів без зайвих послідовностей. • Гнучкість вектора - використовуйте наш лінійний вектор або вектор за вашим вибором • Безкоштовні інструменти - Створюйте ДНК-оліго і багато іншого за допомогою нашого безкоштовного веб-інтерфейсу, який крок за кроком проведе вас через ваш проект • різноманітні програми - Оптимізуйте багато методи синтетичної біології і молекулярної біології за допомогою швидкої комбінації, додавання, видалення або обміну сегментів ДНК.
Початковий текст
Безкоштовний комплект для клонування та складання GeneArt забезпечує одночасне та спрямоване клонування від 1 до 4 фрагментів ПЛР, що складається з будь-якої послідовності, в будь-який лінеаризований вектор, за одну 30-хвилинну реакцію кімнатної температури . У комплекті є все необхідне для складання фрагментів ДНК та їх перетворення в E.coli для відбору та росту рекомбінантних векторів. • Швидкість та легкість? - Клонувати до 4 фрагментів ДНК із послідовністю на ваш вибір одночасно в одному векторі (до 13 Кб); не потрібно обмежувати місця травлення, перев'язки чи рекомбінації • Точність та ефективність- Розроблений, щоб ви могли клонувати те, що ви хочете, в потрібній орієнтації, і досягати до 90% правильних клонів, не залишаючи позаду зайвих послідовностей • Векторна гнучкість - Використовуйте наш лінійний вектор або вектор на ваш вибір • Безкоштовно Інструменти - олиго дизайн ДНК і багато іншого з нашим безкоштовним веб-інтерфейс , який проведе вас крок за кроком через ваш проект • різноманітні додатки - Streamline багато синтетичної біології і методів молекулярної біології з допомогою швидкої комбінації, додавання, видалення або обмін ДНК сегменти
До 4-х фрагментів ДНК можна склеїти в потрібній послідовності за якихось півгодини, причому без головного болю з рестріктазамі або Лігація. І завантажити своє творіння в E. coli для розмноження отриманої конструкції.
Підводячи риску під аналізом рестріктазного сайтів, необхідно визнати, що ніяких однозначних висновків за його підсумками зробити не можна. Хіба що в черговий раз можна було переконатися, що не тільки CoV2 унікальний, але і сам RaTG13 дуже незвичайний товариш, і що варто далі вивчати його біографію.
Кодоновие переваги
З цією метою я ще вирішив поглянути на, щоб подивитися на які штами інших вірусів схожі CoV2 і RaTG13. Не секрет, що віруси схильні підлаштовуватися по своїй кодоновой сигнатуре під переваги їх господарів, тому я очікував побачити у RaTG13 схожий патерн з іншими лечучемишінимі вірусами, а також сподівався побачити відмінність від панголіни штамів.
Ось SARS-CoV, наприклад, дуже схожий на Rs3367 і RsSCH014, як і можна було очікувати:
Між собою, до речі, SARS, MERS і CoV2 розрізняються:
RaTG13 схожий на CoV2, що теж цілком очікувано:
А ось на панголіни штами RaTG13 дійсно не супер схожий, та й між собою панголіни штами не те щоб ідентичні:
На ZXC21 і ZC45 теж не сильно схожий:
З Юньнаньськоє штамів RaTG13 від Rs3367 і RsSCH014 досить далекий, а найближче до LYRa11, але теж з помітними відмінностями:
Загалом, як завжди, RaTG13 і CoV2 стоять якось відокремлено. Ще мене заінтригував AAA кодон - він у них використовується набагато частіше, ніж у одноплемінників:
Ймовірно, це просто чергове збіг, але схожа пропорція між AAA і AAG спостерігається у E. coli . Чи може змінюватися кодоновая сигнатура у cDNA в міру її тривалої культивації в клітинній культурі? У теорії, так, але я поки глибоко цю тему не копав.
Що ж, кодоновий аналіз теж не виявив якихось явних ознак рукотворності, але в черговий раз підтвердив унікальність CoV2 і RaTG13. Що у нас є в сухому отстатке? Поки що лише якийсь набір дивних збігів, який, як люблять висловлюватися вчені, taken together , тобто, в сукупності, змушує дуже сильно задуматися. І вже точно не дозволяє відкинути гіпотезу про рукотворну природу CoV2.
А як же спростування рукотворності в Nature?
Як не дозволяє? А чому авторам тієї статті в Nature дозволяє? Насправді ніякого спростування рукотворності в тій статті немає. Є тільки гучне «нам так не здається», що базується на досить хиткому фундаменті. Самі посудіть - ось основні тези авторів на підтримку нерукотворности:
Хоча наведений вище аналіз передбачає, що SARS-CoV-2 може зв'язуватися з людським ACE2 з високою аффинностью, обчислювальний аналіз передбачає, що його взаємодія не є ідеальним, і що його послідовність RBD відрізняється від показаної оптимальної послідовності для SARS-CoV [перший SARS - Ю.Д.] для зв'язування з рецептором. Таким чином, високоаффіннимі зв'язування шиповидного білка SARS-CoV-2 з людським ACE2, швидше за все, є результатом природного відбору на людському або такому людині ACE2, який дозволив виникнути іншому оптимального рішення для зв'язування. Це переконливий доказ того, що SARS-CoV-2 не є продуктом цілеспрямованих маніпуляцій.
Початковий текст
Хоча наведені вище аналізи дозволяють припустити, що SARS-CoV-2 може пов'язувати людський АСЕ2 з високою спорідненістю, обчислювальні аналізи передбачають, що взаємодія не є ідеальною і що послідовність RBD відрізняється від показаної в SARS-CoV, щоб бути оптимальною для зв'язування рецепторів. Таким чином, високоафіційне зв'язування шипового білка SARS-CoV-2 з АСЕ2 людини, швидше за все, є результатом природного відбору на людському або подібному до людини АСЕ2, що дозволяє виникнути ще одне оптимальне рішення для зв'язування. Це є вагомим доказом того, що SARS-CoV-2 не є продуктом цілеспрямованих маніпуляцій.
Ця цитата в статті наведена прямо під діаграмою, на якій показані ідентичні RBM у CoV2 і панголіни-19. Стривайте, тоді при чому тут «комп'ютерне моделювання»? Найбільш вірогідний сценарій рукотворності - перенесення RBM з штаму однієї тварини в штам іншого - що вірусологи вже робили багато разів. Тому логічний ланцюжок авторів не витримує ніякої критики: «на комп'ютері можна було і крутіше вірус сдізайніть, значить CoV2 - результат природного відбору. О, значить це і є вагомий доказ того, що CoV2 нерукотворен! » Мабуть, погано з логікою у авторів. Подальші їхні тези це підтверджують:
Крім того, якби була проведена генетична маніпуляція, ймовірно, була б використана одна з декількох зворотних генетичних систем, доступних для бета-коронавірусів. Проте, генетичні дані неспростовно свідчать, що SARS-CoV-2 не отримано з будь-якої раніше використаної вірусної основи.
Початковий текст
Крім того, якби була проведена генетична маніпуляція, ймовірно, була б використана одна з кількох реверсно-генетичних систем, доступних для бетакоронавірусів. Однак генетичні дані безперечно показують, що SARS-CoV-2 не походить від жодної раніше використовуваної вірусної системи.
Знову та ж логічна помилка, завуальована гучними оборотами: «генетичний аналіз незаперечно доводить, що CoV2 абсолютно точно не був створений на основі раніше відомих вірусів!» Ну спасибі, Капітан Очевидність. І що, невже творці вірусу не могли зробити cDNA backbone з що раніше не публікувався штаму вірусу - наприклад, з того ж RaTG13? Так легко. Також їм не склало б труднощів потім туди вставити панголіни RBM і фуріновий сайт. Вірусологи цим займаються 20 років, а сучасний інструментарій генної інженерії робить такі маніпуляції доступними навіть студенту.
Щодо виникнення фурінового сайту в клітинній культурі автори теж висловлюють дивні тези:
Придбання як фурінового сайту розщеплення, так і передбачених O-пов'язаних гліканов також суперечить сценаріями виникнення в клітинній культурі. Нові фуріновие сайти розщеплення спостерігалися тільки після тривалого пасирування вірусу пташиного грипу з низькою патогенністю in vitro або in vivo. Крім того, гіпотетична генерація SARS-CoV-2 в клітинній культурі або пасирування в тварин зажадала б попереднього виділення вірусу-попередника з дуже високим генетичним схожістю, яке не було описано . Подальшу освіту фурінового сайту зажадало б повторного пассірованія в клітинній культурі або у тварин з рецепторами ACE2, схожими з такими у людей, але така робота також раніше не була описана .
Початковий текст
Придбання як ділянки багатоосновного розщеплення, так і прогнозованих О-зв'язаних гліканів також суперечить сценаріям, заснованим на культурі. Нові полібазичні місця розщеплення спостерігаються лише після тривалого проходження вірусу пташиного грипу низької патогенності in vitro або in vivo. Крім того, гіпотетична генерація SARS-CoV-2 шляхом клітинної культури або проходження тварин потребувала б попередньої ізоляції вірусу-попередника з дуже високою генетичною схожістю, що не було описано. Подальше генерування ділянки багатоосновного розщеплення потребувало б тоді повторного проходження в культурі клітин або тварин з рецепторами АСЕ2, подібними до людей, але така робота також раніше не описана .
По-перше, самі ж автори раніше призводять посилання на роботи, де фуріновий сайт виникав у міру культивування вірусів в клітинах. А по-друге, що значить, не описаний близький штам вірусу - а як же RaTG13? Якщо в ньому синтетично замінити RBM на панголіни, а потім культивувати химерний штам в клітинній культурі, то фуріновий сайт цілком міг виникнути і таким чином, до того ж, таким же шляхом новий штам міг придбати і інші мутації, що відрізняють CoV2 від RaTG13 і панголіни-19 .
Але в плані саме рукотворного варіанту виникнення фурінового сайту мені більш імовірним видається варіант з цілеспрямованої врізкою - як в іншій китайській роботі від жовтня 2019 року з курячим коронавірусів. А вже потім створений штам міг придбати нові мутації в міру його культивування in vitro або in vivo - як мишачий штам MA15 в 2007 році, наприклад.
Ши Чжэнли-2020
Поки я писав цю статтю, вийшла робота великого колективу китайських вірусологів, включаючи Ши Чженлі, в якій вони ще в лютому протестували проти CoV2 свою багаторічну розробку від багатьох видів коронавірусів - якийсь пептид, який покликаний блокувати злиття шиповидного білка з клітинної мембраною. Автори, звичайно ж, згадують новий фуріновий сайт CoV2, і припускають, що він може грати важливу роль в набагато більш ефективному проникненні CoV2 в клітку:
У цьому дослідженні ми показали, що SARS-CoV-2 демонструє набагато вищу здатність злиття з мембраною, ніж SARS-CoV, що дозволяє припустити, що механізм злиття SARS-CoV-2 є важливою мішенню для розробки інгібіторів злиття коронавируса. ... Як правило, в β-В Коронавіруси відсутня фуріновий сайт S1 / S2, а їх шиповидні білки в нативному стані не розщеплені. Наприклад, SARS-CoV проникає в клітину головним чином через ендосомальной шлях злиття з мембраною, де його шіповідний білок розщеплюється ендосомним Катепсин L і активується. Придбання фурінового сайту S1 / S2 може значно збільшити здатність шиповидного білка SARS-CoV проникати через клітинну мембрану.
Початковий текст
У цьому дослідженні ми показали, що SARS-CoV-2 виявляє набагато більшу ємність мембранного синтезу, ніж SARS-CoV, що дозволяє припустити, що техніка синтезу SARS-CoV-2 є важливою ціллю для розвитку інгібіторів коронавірусного синтезу. … Як правило, коронавірусам β-B не вистачає місця розпізнавання фуріну S1 / S2, а їх S білки не розщеплюються у нашому стані. Наприклад, SARS-CoV надходить у клітину головним чином шляхом злиття ендосомної мембрани, де її S білок розщеплюється ендосомним катепсином L та активується. Індукування сайту розпізнавання S1 / S2 фуріна може значно збільшити здатність білка SARS-CoV S до опосередкування інфекції клітинної поверхні.
У цьому контексті стає цікаво, а не проводили автори раніше якісь експерименти по тому, як на ефективність їх пептиду може впливати додавання нових фурінових сайтів в різні коронавіруси? Але не будемо будувати зайві здогади, дозволимо часу розставити все по своїх місцях.
До речі, Барік, мабуть, вирішив не відставати від Ши Чженлі, і теж приєднався до гонки з пошуку коштів від CoV2. Як я зрозумів, він і співавтори взяли вже були у них дані про ефективність свого нуклеозидного аналога (β-D-N4-hydroxycytidine, NHC) проти SARS-CoV і MERS, додали in vitro дані по CoV2, і відправили до друку. Нуклеозидні аналоги (як, наприклад, знаменитий ремдесівір ) - це принципово інший підхід, ніж у Ши Чженлі і співавторів: тут автори намагаються перешкодити реплікації вірусу, підсовуючи йому «дефективних» літери генетичного алфавіту, а Ши Чженлі і співавтори намагаються не дати вірусу проникнути в клітку. Теоретично, ці підходи можна буде комбінувати.
Це кінець, прекрасний друже
Ох, сподіваюся до цього моменту хоч хтось дочитає. Вибачте, якщо втомив вас. Сам в шоці: кроляча нора виявилася цілим підземним царством. Ще сподіваюся, що вам було цікаво зануритися в світ вірусології та неупереджено розглянути гіпотезу рукотворної природи CoV2. На мій погляд, наведений мною масив даних, в сукупності, не дозволяє відкинути цю гіпотезу.
Про всяк нагоди, поясню: це НЕ означає, що CoV2 точно був синтезований в лабораторії. Так, чисто технічно, створити такий штам сучасному вірусологу не склало б труднощів. Але прямих доказів того, що хто-небудь це зробив, немає. А дивні збіги поки не можуть служити навіть непрямими доказами.
Але і зворотна гіпотеза про виключно натуральної природі вірусу теж ще вагомими доказами не підкріплена. Поки не виявлено проміжних предків між RaTG13, панголіни-19 і CoV2, в яких би можна було простежити ту селективну рекомбінацію, яку ми спостерігаємо у CoV2, питання про його походження залишається відкритим. Мабуть, краще самого Ральфа Баріка на цю тему не висловиться ніхто:
Які тварини є зоонозними носіями SARS-CoV-2?Такі тварини поки не знайдені. Є відомості, що панголіни потенційно можуть бути проміжним господарем, але віруси панголіни лише на 88-98% ідентичні SARS-CoV-2. Для порівняння, штами Росса і єнотовидних коронавирусов першого SARS були на 99,8% ідентичні штамів SARS-CoV 2003 року. Іншими словами, ми говоримо про декілька мутацій між штамами Росса, єнотовидних і людей в 2003 році. Панголіни [штами CoV2] мають більше 3000 нуклеотидних змін, тому панголіни жодним чином не можуть бути резервуарним видом. Абсолютно без шансів.
Початковий текст
Який вид водосховища SARS-CoV-2?Вони не визначили реальних видів водойм. Звіти показують, що панголіни потенційно є проміжним господарем, але віруси панголіну на 88–98% ідентичні SARS-CoV-2. Для порівняння, штам циветів та єнотів коронавірусів ГРВІ був на 99,8% ідентичним SARS-CoV 2003 року. CoV2] мають понад 3000 нуклеотидних змін, але вони не є видами резервуарів. Абсолютно немає шансів.
/https%3A%2F%2Fhabrastorage.org%2Fgetpro%2Fhabr%2Fpost_images%2Ff61%2F9f6%2F4c6%2Ff619f64c632d1eac215da29ae752b100.png)
/https%3A%2F%2Fhabrastorage.org%2Fwebt%2Ffi%2F0x%2F4z%2Ffi0x4z2nhcc3-3bdzugakb4csji.png)
/https%3A%2F%2Fhabrastorage.org%2Fgetpro%2Fhabr%2Fpost_images%2F5df%2F3d5%2Faad%2F5df3d5aad6246e32b038f36802afc6ff.png)
/https%3A%2F%2Fhabrastorage.org%2Fgetpro%2Fhabr%2Fpost_images%2F7e9%2F8ea%2F1a0%2F7e98ea1a0c6c81da5ae9a3aa366cbbe9.png)
/https%3A%2F%2Fhabrastorage.org%2Fgetpro%2Fhabr%2Fpost_images%2F9e4%2F1ca%2F2e0%2F9e41ca2e0b093ee7558eb089d38bac13.png)
/https%3A%2F%2Fhabrastorage.org%2Fgetpro%2Fhabr%2Fpost_images%2F046%2F388%2Fe7f%2F046388e7fb0beea71b7be894ff6a6cba.png)
/https%3A%2F%2Fhabrastorage.org%2Fgetpro%2Fhabr%2Fpost_images%2Fc26%2F8e0%2Fb28%2Fc268e0b28a933cb678eb4bd6a1cf8648.png)
/https%3A%2F%2Fhabrastorage.org%2Fgetpro%2Fhabr%2Fpost_images%2Fc58%2F842%2F552%2Fc588425528044baf081f05588fffca22.png)
/https%3A%2F%2Fhabrastorage.org%2Fgetpro%2Fhabr%2Fpost_images%2Fac7%2Fc6f%2Fef2%2Fac7c6fef2883f8b4bf72d5578990ec76.png)
/https%3A%2F%2Fhabrastorage.org%2Fgetpro%2Fhabr%2Fpost_images%2F07d%2Fa75%2F417%2F07da75417ef55db38945c9b0f13819d1.png)
/https%3A%2F%2Fhabrastorage.org%2Fwebt%2Fwp%2F_2%2Fg9%2Fwp_2g9z0flpa3oxfojossayyf9o.png)
/https%3A%2F%2Fhabrastorage.org%2Fwebt%2Fa6%2Fgg%2Fzp%2Fa6ggzpvuxowphdftv_d6l61n0k8.png)
/https%3A%2F%2Fhabrastorage.org%2Fgetpro%2Fhabr%2Fpost_images%2Fda1%2Fff2%2F051%2Fda1ff2051751e4f50cc5baeb856bf638.png)
/https%3A%2F%2Fhabrastorage.org%2Fgetpro%2Fhabr%2Fpost_images%2F047%2Fa72%2F4ab%2F047a724ab92edcc97b2b7866a3ba79a4.png)
/https%3A%2F%2Fhabrastorage.org%2Fgetpro%2Fhabr%2Fpost_images%2F52a%2Ff0d%2Fc3c%2F52af0dc3cfa126b2bb6c991ddc451d33.png)
/https%3A%2F%2Fhabrastorage.org%2Fgetpro%2Fhabr%2Fpost_images%2F595%2F45b%2Fada%2F59545bada2129fc33ffe0c06d0ba6b1b.png)
/https%3A%2F%2Fhabrastorage.org%2Fgetpro%2Fhabr%2Fpost_images%2F09a%2F763%2Fdd8%2F09a763dd85fea5d0fe7d3ef8f11ae239.png)
/https%3A%2F%2Fhabrastorage.org%2Fgetpro%2Fhabr%2Fpost_images%2Fbaa%2F50b%2F10f%2Fbaa50b10f2b1af00e1a1e8a10e23a17d.png)
/https%3A%2F%2Fhabrastorage.org%2Fgetpro%2Fhabr%2Fpost_images%2F493%2F013%2F0c7%2F4930130c77fc6bb955806ecd0dfb5c79.png)
/https%3A%2F%2Fhabrastorage.org%2Fgetpro%2Fhabr%2Fpost_images%2F83a%2Fa21%2F8e9%2F83aa218e9ac0926d9bc514c47281184b.png)
/https%3A%2F%2Fhabrastorage.org%2Fgetpro%2Fhabr%2Fpost_images%2Fc3d%2Fb8a%2F566%2Fc3db8a566877797ba5829cf23a039635.png)
/https%3A%2F%2Fhabrastorage.org%2Fgetpro%2Fhabr%2Fpost_images%2Fada%2F9e0%2F17c%2Fada9e017cc0e7c45c1bf0cfff3488f7f.png)
/https%3A%2F%2Fhabrastorage.org%2Fgetpro%2Fhabr%2Fpost_images%2F008%2Feaf%2F592%2F008eaf592574cba565f9d2f6ab5d4f79.png)
/https%3A%2F%2Fhabrastorage.org%2Fwebt%2Fap%2F7l%2Fyu%2Fap7lyu5fqeg_p8trsy4vqlmoix4.png)
/https%3A%2F%2Fhabrastorage.org%2Fgetpro%2Fhabr%2Fpost_images%2F23c%2Fbb3%2Fb86%2F23cbb3b86305a9572ecccfcbc8a22305.png)
/https%3A%2F%2Fhabrastorage.org%2Fgetpro%2Fhabr%2Fpost_images%2Fc17%2F74b%2F6bf%2Fc1774b6bf95d0517b96c6f9ddcc7024e.png)
/https%3A%2F%2Fhabrastorage.org%2Fwebt%2Fju%2Fuw%2Ffq%2Fjuuwfqel6vk6tvqilou7ezrze4i.png)
/https%3A%2F%2Fhabrastorage.org%2Fgetpro%2Fhabr%2Fpost_images%2F0b8%2Fcbe%2F28f%2F0b8cbe28f6e6e41435088ac92d014a7c.png)
/https%3A%2F%2Fhabrastorage.org%2Fwebt%2Fx5%2Fb6%2F06%2Fx5b606tbipv1rn-pqectcw2vmzk.png)
/https%3A%2F%2Fhabrastorage.org%2Fwebt%2F-g%2Fqv%2Ffl%2F-gqvflspt2n8vm8msfo7as09lfk.png)
/https%3A%2F%2Fhabrastorage.org%2Fgetpro%2Fhabr%2Fpost_images%2F03f%2Fe6b%2Ffc2%2F03fe6bfc2fad1d03fd3a0b16bc538ab9.png)
/https%3A%2F%2Fhabrastorage.org%2Fgetpro%2Fhabr%2Fpost_images%2F0b8%2F29e%2F754%2F0b829e754f3362ba124def01048d0bba.png)
/https%3A%2F%2Fhabrastorage.org%2Fgetpro%2Fhabr%2Fpost_images%2Ffa7%2Fbdb%2F96a%2Ffa7bdb96a4fe78a56d185fe48c5c809c.png)
/https%3A%2F%2Fhabrastorage.org%2Fgetpro%2Fhabr%2Fpost_images%2F555%2Ffe0%2Fc96%2F555fe0c96cf0c77a57574d3027ba2c31.png)
/https%3A%2F%2Fhabrastorage.org%2Fgetpro%2Fhabr%2Fpost_images%2F8a4%2F27f%2Fe2c%2F8a427fe2c86807b79be6a32efde8f56e.png)
/https%3A%2F%2Fhabrastorage.org%2Fgetpro%2Fhabr%2Fpost_images%2F529%2F757%2Fb5b%2F529757b5b59118788ed05ebcee5c4e8a.png)
/https%3A%2F%2Fhabrastorage.org%2Fgetpro%2Fhabr%2Fpost_images%2F7f5%2Fd39%2Ff95%2F7f5d39f95fa1168fa0fbe4491df69456.png)
/https%3A%2F%2Fhabrastorage.org%2Fwebt%2F9o%2Fuj%2Fxu%2F9oujxuxgzxlia8o8t6fdjcsygu4.png)
/https%3A%2F%2Fhabrastorage.org%2Fgetpro%2Fhabr%2Fpost_images%2F6bf%2Fee4%2Fc3a%2F6bfee4c3a4a94bf60a525a1b22620456.png)
/https%3A%2F%2Fhabrastorage.org%2Fgetpro%2Fhabr%2Fpost_images%2F294%2Fb21%2Fee9%2F294b21ee9dbb3d6f387d458c8ce1146c.png)
/https%3A%2F%2Fhabrastorage.org%2Fgetpro%2Fhabr%2Fpost_images%2F2df%2F91c%2Fc29%2F2df91cc299208501cd736b4c3652433e.png)
/https%3A%2F%2Fhabrastorage.org%2Fgetpro%2Fhabr%2Fpost_images%2Fccd%2Ff81%2F121%2Fccdf8112198fa480aebee48d16cb595d.png)
/https%3A%2F%2Fhabrastorage.org%2Fgetpro%2Fhabr%2Fpost_images%2F64b%2F2e0%2Fbb3%2F64b2e0bb3a8a447ed5bc0805f0d8e403.png)
/https%3A%2F%2Fhabrastorage.org%2Fgetpro%2Fhabr%2Fpost_images%2F8b7%2Fa2d%2Ffa4%2F8b7a2dfa4af96ed4649eec6b53a96a84.png)
/https%3A%2F%2Fhabrastorage.org%2Fwebt%2Flk%2Fyw%2Fr5%2Flkywr5wi9t3z6g3bj5phgbnhu9y.png)
/https%3A%2F%2Fhabrastorage.org%2Fwebt%2Fjd%2Fm_%2Faw%2Fjdm_awiat-0-e6tstpm2gk1xjam.png)
/https%3A%2F%2Fhabrastorage.org%2Fwebt%2Fix%2Fdw%2Fwd%2Fixdwwdufidplsqru-5o581lapom.png)
/https%3A%2F%2Fhabrastorage.org%2Fwebt%2Fz5%2Foz%2F7y%2Fz5oz7yyz_nxu5qmwa7mgnnxz2ci.png)
/https%3A%2F%2Fhabrastorage.org%2Fgetpro%2Fhabr%2Fpost_images%2F44e%2Ffd4%2Fe4e%2F44efd4e4eda10d4ac61bc798b91a2259.png)
/https%3A%2F%2Fhabrastorage.org%2Fwebt%2Ftg%2F1x%2F-n%2Ftg1x-nfgwm-4hcs0oule3ryarbs.png)
/https%3A%2F%2Fhabrastorage.org%2Fgetpro%2Fhabr%2Fpost_images%2F6b6%2Ff89%2Ff3c%2F6b6f89f3c6569134e023778e2d81639a.png)
/https%3A%2F%2Fhabrastorage.org%2Fgetpro%2Fhabr%2Fpost_images%2Fbd5%2Ffd6%2F322%2Fbd5fd6322db1e9a50b41b9a78cdc01e5.png)
/https%3A%2F%2Fhabrastorage.org%2Fgetpro%2Fhabr%2Fpost_images%2F388%2Fc32%2F4bd%2F388c324bd993aeaea221a7fb98f036e4.png)
/https%3A%2F%2Fhabrastorage.org%2Fgetpro%2Fhabr%2Fpost_images%2Fd3b%2Fcf0%2F916%2Fd3bcf09160ac657d756d56eadabb5036.png)
/https%3A%2F%2Fhabrastorage.org%2Fgetpro%2Fhabr%2Fpost_images%2Fc6b%2Fdf0%2F348%2Fc6bdf03486c3d1564a3fc6c2da45789b.png)
/https%3A%2F%2Fhabrastorage.org%2Fgetpro%2Fhabr%2Fpost_images%2Fc5b%2F761%2Fec2%2Fc5b761ec2455244434c5673157f4e74a.png)
/https%3A%2F%2Fhabrastorage.org%2Fgetpro%2Fhabr%2Fpost_images%2F65f%2F5f6%2Fd83%2F65f5f6d832d5f7fba40bdc4380d03147.png)
Коментарі
Дописати коментар
Олег Мічман в X: «Donations and support for media resources, bloggers, projects, and individuals. https://t.co/HPKsNRd4Uo https://t.co/R6NXVPK62M» / X
https://twitter.com/olukawy/status/1703876551505309973